Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
1) 1%-ный раствор поверхностно-активных веществ типа ОП-7, ОП-10, ТВИН-60 или ТВИН-80 в дистиллированной воде (трехкратно);
2) дистиллированную воду (трехкратно);
3) ацетон или метанол (двукратно);
4) бензол (двукратно);
5) диэтиловый спирт (двукратно);
6) растворитель, в котором будет растворяться неподвижная жидкая фаза (трехкратно).
После этого колонку продувают азотом и помещают в сушильный шкаф при температуре 70—80 °С на 1 ч.
Готовят наполнитель для колонки. Для этого подбирают соответствующую жидкую фазу и 5—15 % ее наносят на выбранный инертный носитель. Необходимое количество жидкой фазы (например, 10 г), растворенной в соответствующем растворителе (хлороформ или ацетон), вносят в круглодонную колбу со шлифом и туда же добавляют определенное количество (например, 100 г) твердого носителя. Колбу присоединяют к роторному испарителю и при вращении выпаривают растворитель полностью. Инертный носитель, пропитанный жидкой фазой, раскладывают тонким слоем на фильтровальной бумаге и подсушивают под вытяжным шкафом, а затем в термостате при 80—100 °С до хорошо выраженной сыпучести. В таком виде наполнитель готов для использования.
Колонку заполняют следующим образом. Один конец закрывают стеклянной ватой (на глубину 0,7—1,5 см) и присоединяют к вакуумному насосу, а к другому присоединяют воронку (через резиновую трубку). Наполнитель засыпают через воронку при постоянном постукивании палочкой до тех пор, пока колонка не заполнится полностью, после чего открытый конец закрывают стеклянной ватой. Наполнитель должен заполнить колонку достаточно плотно, без пустот. Для его уплотнения колонку можно присоединить к баллону с азотом и на 1—2 мин пустить с напором газ, постоянно постукивая палочкой.
После этого колонку вставляют в хроматограф и подвергают «тренировке», которая сводится к прогреванию ее в течение 15—20 ч при температуре несколько более высокой, чем та, при которой она будет работать, но ниже допустимой для данной жидкой фазы. В против-
159
ном случае последняя улетучивается. Во время прогревания колонки через нее пропускают слабый поток газа-носителя (5—10 мл/мин). При этом второй конец колонки, обращенный к детектору, не присоединяют, чтобы исключить загрязнение последнего.
После завершения «тренировки» колонки нагреватель термостата выключают, охлаждают до комнатной температуры, не выключая газа-носителя, что предупреждает конденсацию влаги внутри колонки при охлаждении. Затем колонку присоединяют к детектору, прибор включают и выводят на рабочий режим, на котором предусматривается разделение метиловых эфиров жирных кислот. В рабочий режим прибора входят следующие параметры: температура, скорость подачи газа-носителя, водорода и воздуха. От правильной установки и поддержания режима работы зависит качество разделения жирных кислот.
Выбор режима работы прибора. Для каждой марки хроматографа устанавливают свой режим, но чаще всего такой: температура колонки 160—190 °С, испарителя 220—240 °С, поток газов: носителя — 30— 75 мл/мин, водорода — 40—60 и воздуха — 300—400 мл/мин. Для стабилизации режима работы прибор включают и прогревают при заданной температуре 1,5—2 ч. До прогревания прибора следует убедиться, что в газовой системе нет утечки газов. Для этого все контакты колонки с баллонами и прибором смазывают мыльной пеной. После прогревания нужно убедиться в стабильности температуры термостата и базисной линии самописцев. С этой целью в колонку 2—3 раза вводят микродозы (1—3 мкл) хлороформа или гексана, для чего пользуются специальными микрошприцами вместимостью от 1 до 10 мкл.
Приготовление метиловых эфиров жирных кислот. Поскольку жирные кислоты нелетучие соединения, их перед введением в хроматограф следует перевести в летучие — метиловые эфиры. Приводим два наиболее удобных и быстро выполнимых способа метилирования жирных кислот.
1. Липидный экстракт в дозе, соответствующей 5—20 мг чистых липидов, вносят в пробирку с притертой пробкой и выпаривают растворитель струей азота. В пробирку добавляют 2 мл 0,5 моль/л натрия метилата, закрывают и оставляют стоять при комнатной температуре 30—40 мин или подогревают на песочной бане до 50—55 °С. Реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 6 моль/л раствора HCl.
Затем в пробирку вносят 4 мл петролейного эфира и 4 мл дистиллированной воды, закрывают и содержимое энергично встряхивают, дают отстояться и с помощью бактериологической пипетки с резиновой грушей верхний петролейный слой переносят в пе-нициллиновый флакон с сульфат-карбонатной смесью и сушат 10 мин. После этого петролейный эфир и растворенные в нем метиловые эфиры переносят в короткую пробирку с притертой пробкой, петролейный эфир удаляют струей азота, а оставшиеся метиловые эфиры растворяют в 2—3 каплях хлороформа, гексана, сероуглерода или в другом подходящем растворителе и с помощью шприца вводят в хроматограф (0,5—1 мкл).
160
2. В ампулу вносят 5—20 мг липидов, раствор испаряют струей азота и добавляют 2 мл метилирующей смеси (0,3 н. раствор хлористого водорода или 3%-ный раствор серной кислоты в абсолютном метаноле). Ампулу запаивают на газовой горелке и помещают в термостат на 1—2 ч при температуре 105 °С. После охлаждения содержимое ампулы небольшими порциями переносят на бумажный фильтр и быстро просушивают под феном. Затем фильтр сгибают на угол и метиловые эфиры осторожно смывают гексаном (5—6 мл) в пробирку. Гексан удаляют струей азота (при 45—50 °С) до минимума, а сконцентрированные метиловые эфиры (соломенного цвета) используют для анализа.
