Методы ветеринарной клинической лабораторной диагнотики - Кондрахин И.П.
ISBN 5-9532-0165-6
Скачать (прямая ссылка):
В результате взаимодействия ненасыщенных жирнокислотных остатков фосфолипидов липидного бислоя мембран с активными формами кислорода образуются и накапливаются гидропероксиды фосфолипидов, что увеличивает подвижность полипептидной цепи белков. Это сопровождается деформацией мембранного липо-протеидного комплекса, повышенной проницаемостью биомембран клеток и субклеточных элементов для протонов и воды, инги-бированием активности мембраносвязанных ферментов, появлением «пор» в структуре, фрагментацией и разрушением мембран, а в итоге — цитолизом и гибелью клетки.
Однако в связи с неустойчивостью в организме первичных продуктов ПОЛ к их исследованиям прибегают редко. Предпочтение
167
отдается определению концентрации более устойчивых вторичных и конечных продуктов ПОЛ, в частности малонового диальдегида (МДА) и соединений типа оснований Шиффа.
В противовес образованию различных продуктов ПОЛ в организме животных сложилась и активно функционирует специальная система антиоксидантной защиты, суть которой сводится к торможению процессов разрушения биомембран и нарушения функциональной активности белков-ферментов. Система антиоксидантной защиты состоит из ферментативных реакций, протекающих с участием таких ферментов, как супероксиддисмутаза (КФ.1.15.1.1), каталаза (КФ.1.11.1.6), пероксидаза (КФ.1.11.1.7), глу-татионпероксидаза (КФ.1.11.1.9), глутатионредуктаза (КФ.1.6.4.2), и неферментативных соединений, среди которых особое место занимают витамин Е, а также витамин С, глутатион, каротин, витамины А и К, убихинон (коэнзим Q) и другие соединения.
На каждом из этапов развития пероксидных реакций существует своя специализированная система защиты. Часть этих систем строго специфична, например супероксиддисмутаза (СОД). Другие, такие, как глутатионпероксидаза (ГП), а-токоферол, обладают большей широтой действия и меньшей субстратной специфичностью.
Дополняющие друг друга ферментативная и неферментативная антиоксидантные системы в норме обеспечивают сдерживание активации процессов пероксидного окисления липидов и тем самым предупреждают поражение организма животных продуктами ПОЛ. На эффективность антиоксидантной системы значительное влияние оказывает полноценность кормления животных, особенно уровень обеспеченности их витаминами и микроэлементами.
Определение диеновых конъюгатов и кетодиенов полиненасыщенных жирных кислот в крови. Принцип. Процесс пероксидного окисления полиненасыщенных жирных кислот сопровождается перегруппировкой двойных связей и возникновением системы сопряженных диеновых структур, имеющих максимум поглощения при 232—234 нм с плечом в области 260—280 нм, соответствующим сопряженным кетодиенам.
Реактивы: экстрагирующая смесь: гептан-изопропиловый спирт 1 : 1 (об/об.); спирт этиловый 96%-ный.
Оборудование: спектрофотометр; водяная баня; центрифуга с охлаждением; баллон с газообразным азотом; пробирки химические и центрифужные; пипетки на 1,5 и 10 мл.
Ход определения. В центрифужные пробирки вносят по 1 мл гепаринизированной крови, приливают по 7 мл экстрагирующей смеси, закрывают корковыми (не резиновыми!) Пробками и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. Затем пробирки (пробы) центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин-1 при температуре 0—4 °С. 2 мл верхнего гептанового слоя переносят в чистые химические пробирки и выпаривают в токе азота на водяной бане при 40—50 °С. К сухому остатку пробы приливают 3 мл этилового спирта,
168
пробирки интенсивно встряхивают, оставляют на 10—15 мин при комнатной температуре и перед измерением еще раз встряхивают.
Относительную плотность опытных проб измеряют на спектрофотометре при 232 и 273 нм против контрольной пробы (этилового спирта) в кюветах с ходом луча 10 мм.
В этих же пробах определяют содержание общих липидов суль-фованилиновым методом.
Расчет содержания диеновых конъюгатов (ДК) и кетодиенов (КД) ведут по формуле
r _ ^4232(4273)
Чдк(вд) ^ >
где СдК(вд\ — содержание диеновых (кетодиеновых) конъюгатов в единицах оптической плотности на 1 мг липидов; ?4232(4273) — оптическая плотность пробы для диеновых (кетодиеновых) конъюгатов; А — содержание общих липидов в пробе.
Примечание. Гепаринизированную кровь исследуют не позднее 6 ч после взятия и хранении при температуре не выше 10 °С.
Клиническое значение. Повышение концентрации в крови (плазме и эритроцитах) диеновых конъюгатов (ДК) и кетодиенов (КД) полиненасыщенных жирных кислот свидетельствует об усилении в организме процессов ПОЛ, вызываемых как эндогенными [острые и хронические воспаления, сепсис, снижение антиокислительной активности (AOA) липидов и естественных ан-тиоксидантов в организме — витаминов Е, С, К, каротина, фосфолипидов, селена и др.], так и экзогенными (лучевое поражение, эмоциональные, болевые и технологические стрессы и др.) факторами. Постепенное снижение концентраций ДК и КД до оптимального уровня свидетельствует об успешном лечении и благоприятном прогнозе. Резкое падение (ниже среднего уровня) концентраций указанных продуктов ПОЛ, как правило, свидетельствует о глубоких необратимых деструктивных процессах биологических мембран. Концентрация ДК у животных колеблется от 0,100 до 0,300 ед. опт. пл/мг липидов.
