Основы общей и сельско-хозяйственной радиобилогии - Гудков И.Н.
ISBN 5-7987-0005-4
Скачать (прямая ссылка):
Обнаружение разрыва
Надрезание участка молекулы несущего повреждение
Выщепление и удаление поврежденного участка
Синтез ДНК- замещение
Сшивка концов синтезирован-ного участка с молекулой
механизма репарации
ной схеме, получил название эксцизионной репарации. Но описаны и другие типы репарационного синтеза ДНК. Большинство хотя и имеют определенные особенности, в целом напоминают данную схему, сущность которой определяется принципом «выщепление—замещение».
Для репарации двунитевых, или двойных, разрывов ДНК необходимо, чтобы клетка обладала активной системой рекомбинации и наличием неповрежденных участков ДНК, гомологичных участкам, содержащим двойные разрывы.
Но до недавнего времени не было достаточно четких доказательств существования молекулярной репарации ДНК в растительных клетках. Более того, в связи с тем, что попытки обнаружить систему ферментов репарации в растениях и процессы репаративной репликации окончились безуспешно, в 60-е годы было высказано предположение о принципиальном отличии животных и растительных клеток, состоящем в утрате последними механизмов репарации ДНК.
Отрицание существования молекулярной репарации у растений выглядело несколько неожиданно, так как противоречило общим принципам организации живого на молекулярном и клеточном уровнях, исключало существование в клетках растений важнейшего механизма, призванного следить за неизменностью структуры ДНК, стабильностью генетического кода. Поэтому поиски репарирующих систем у растений проводились параллельно во многих лабораториях. И хотя в связи с отсутствием у высших растений соответствующих мутантных форм, как у бактерий, не было получено прямых сведений о последовательном ходе этапов репликативной репарации, было получено достаточно много фактов, свидетельствующих о ее существовании.
Так, В. Н. Сойферу и К. К. Цеминису (1974) впервые удалось установить факт вырезания нуклеотидных оснований в ДНК облученных проростков чины, то есть выявить возможность существования у высших растений первых этапов репарации ДНК, идущей по принципу «выщепление — замещение». Г. Хоуленд (1975) в опытах с клетками моркови показал растущее с увеличением дозы ионизирующей радиации количество выщеп-ляемых пиримидиновых димеров их ДНК, то есть доказал возможность существования эксцизионного этапа восстановления. X. Ямагучи и соавторы (1977) установили наличие у растений специфических для репаратив-
Рис. 27. Характерные профили седиментации ДНК при центрифугировании ее в градиенте щелочной сахарозы:
й — в норме; б — тотчас после облучения; в—г— через различное время после облучения, измеряемое часами
ной репликации ДНК-полиме-раз.
Важным доказательством существования у высших растений механизмов молекулярной репарации ДНК является установление в ряде лабораторий репарации разрывов ДНК по восстановлению ее молекулярного веса с помощью метода центрифугирования в щелочном градиенте сахарозы.
Суть его состоит в том, что при центрифугировании препаратов ДНК состояние ее отдельных фракций по молекулярному весу описывается соответствующей седиментограммой с характерным пиком в максимуме молекулярного веса. При возникновении в ДНК при облучении разрывов ее молекулярный вес уменьшается. На седиментограмме это отражается смещением пика в сторону более легких фракций ДНК (рис. 27). И в опытах с самыми разными видами растений было совершенно однозначно показано, что с увеличением времени между облучением растений и выделением ДНК профиль ее седиментации все в большей степени возвращался к нормальному, то есть первоначальному состоянию.
Одним из доказательств возможности молекулярной репарации ДНК служит демонстрация дополнительного включения предшественников в ДНК облученных клеток— так называемого внепланового синтеза ДНК, отражающего этап комплементарного синтеза в месте пробела молекулы, возникшего после выщепления поврежденного участка. Поскольку интенсивность репаративно-го синтеза ДНК по сравнению с репликативным довольна низка, его обычно устанавливают в ДНК-несинтезирую-щие периоды клеточного цикла (в пре- и постсинтетичес-
кие фазы) по включению специфического меченого предшественника ДНК тимидина (3Н-тимидин). Это можно сделать только на синхронно делящихся клетках, то есть при работе с тканью или клеточной популяцией, в которой все клетки одновременно проходят фазы клеточного цикла, чего практически никогда не бывает в естественных условиях, но чего отчасти удается достичь в условиях лаборатории с помощью уже упоминавшихся в главе 4 синхронизаторов делений. Но даже лучшие из них позволяют добиться не более чем 80—90 %-ной синхронности деления. Не вовлеченные же в одновременное деление клетки, реплицируясь в любое подходящее для них время, не дают возможности показать существование внепланового синтеза ДНК. Именно поэтому долгое время не было фактов, доказывающих его индукцию в клетках высших растений под влиянием ионизирующих излучений.
Нами совместно с Д. М. Гродзинским в 1973 г. был предложен принципиально новый подход к решению этой задачи. Известно, что в зародышах покоящихся семян до 100% клеток может находиться в фазе покоя — в так называемой Go-фазе. При набухании и прорастании семян они вступают в пресинтетическую фазу и лишь пройдя ее — в фазу синтеза ДНК. С помощью методов цитофотометрии и авторадиографии было установлено, что в клетках зародышевых меристем семян гороха до 97 % клеток находятся в Go-фазе, а остальные — в Ог-фазе. При прорастании семян при комнатной температуре первые ДНК-синтезирующие клетки появляются лишь через 30 ч. До этого периода состав клеток меристем зародыша не меняется и практически полностью оказывается представленным клетками, находящимися в пресинтетической фазе.
