Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
12.2.1.1. Препаративные методы и анализ с помощью метода рентгеновского микроанализа
Наши методы приготовления срезов тканей для изучения с помощью рентгеновского микроанализа обсуждались более детально ранее (Smith et al., 1978; Cameron et al., 1979, 1980a, b; Pool et al.,
1980). Мы применили методы, первоначально разработанные для авторадиографического обнаружения веществ, способных к диффузии
365
на сухих образцах (Stumpf, Roth, 1966,1969; Brown et al., 1969). Тка* невые срезы площадью 1—2 мм2, взятые у животных, умерщвленных посредством цервикальной дислокации, помещали на кончик латунного трубкообразного держателя, используя в качестве смазки тщательно измельченную печень. Латунный стержень с приклеенным кусочком ткани переносили в жидкий пропан, который хранился в бане с жидким азотом. После такого быстрого замораживания образец переносили в криостат с жидким азотом. В криостате поддерживали температуру —30 °С. Процедура от забоя животных до замораживания занимала меньше 60 с. Всякий раз, когда это было возможно, мы использовали свежую поверхность образца, чтобы не анализировать поврежденные клетки. В том случае, если это невозможно, поступали следующим образом: несколько поверхностных срезов блока отбрасывали и лишь затем готовили срезы для рентгеновского микроанализа. Срезы толщиной 4 мкм помещали в криосорбционный аппарат внутри криостата и лифилизировали в течение ночи. В то время как одно отделение криосорбционного аппарата находилось в жидком азоте, камеру с образцами можно было нагреть до комнатной температуры, а затем медленно возвратить атмосферное давление с помощью газообразного азота. Лиофилизировашше образцы хранили в вакуумном эксикаторе над сухим кальцием.
Для анализа и получения отпечатков срезы помещали над 1—2-миллиметровым отверстием угольной планшетки диаметром 1 см. Срезы прикрепляли к краям отверстия планшетки, используя небольшое количество смазки. Таким образом, непокрытые и неподдерживаю-щиеся участки срезов анализировали при 15 kV в JEOL JSM35-cKa-нирующем микроскопе, соединенном с ядерным полупроводниковым Si (Ы)-рентгеновским детектором. Образцы находились на расстоянии 1,5 см от детектора под углом 40°. Полученные данные обрабатывали с помощью высокоимпульсной системы NS-880 (Тгасог Northern, Middleton, Wisconsin). Электронные фотографии использовали для визуального морфологического изучения. Площадь поверхности цитоплазмы для каждой клетки составляла 1,6 мкм2 и время реального счета — 100 с. Рентгеновское высокоимпульсное распределение измеряли при энергии 0—10,22 кеУ с разрешением 20 eV на канал. Тгасог Northern Super ML-программа применялась для расшифровки спектра и вычисления сигнала элемента из фона. Фон произвольно выбирали в интервале энергии 4,5—5 кеУ, при которой соответствующие для каждого элемента сигналы в образцах не появляются. Затем отношение характеристичного сигнала к фону для каждого элемента сравнивали с серией стандартов, содержащих известную массу солей в бычьем сывороточном альбумине. Лиофилизировашше 4-микро-метровые срезы растворов альбумина готовили и анализировали точно так же, как и тканевые образцы. Подбирали такой состав стандартов, какой был в биологических образцах (приблизительно 20 % сухой массы). Расчет производили по стандартным кривым, опубликованным ранее (Cameron et al., 1979). Концентрацию элементов выражали в ммоль/кг сухой массы.
366
12.2.1.2. Обоснование метода
Надежность выбранного нами препаративного метода сохранения естественного распределения элементов, способных к диффузии, проверялась (Pool et al., 1980) и обсуждалась (Cameron et al., 1979) ранее более детально. Здесь дается лишь краткое обсуждение надежности метода.
Наш выбор толщины срезов 4 мкм и энергии высокоимпульсного распределения при 15 к V основан на следующих соображениях: глубина проникновения электронов, имеющих энергию 15 kV, в лиофилизи-рованные срезы тканей больше, чем диаметр клетки любого исследованного нами типа. Заметим, что диаметр анализируемых клеток был больше чем 4 мкм. При использовании более тонких срезов требуются более тонкий пучок рентгеновских лучей и более продолжительное время для подсчета импульсов, но увеличивается вариабельность данных. Прямая зависимость между отношением сигнала элемента к фону и концентрацией элементов основана на тех данных, что излучение характеристичного сигнала производится элементами, присутствующими в анализируемом образце. Чтобы подтвердить правильность выбора толщины срезов, составляющей 4 мкм и обеспечивающей надежную количественную оценку отношения сигнала к фону, мы для сравнения исследовали срезы 20 %-ных (иЫ) желатиновых блоков толщиной 2 мкм, содержащих известное количество солей. Результаты статистического анализа не показали резких отличий содержания элементов при использовании срезов различной толщины. Отношение сигнала к фону — преимущество при анализе срезов разной толщины, и, следовательно, локальное содержание незначительно влияет на количественное определение элементов.
