Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Скорость замораживания образцов также влияет на определение содержания элементов. Если скорость замораживания ткани низкая, то во внеклеточной жидкости будут образовываться кусочки льда до их формирования внутри клетки. Такое обстоятельство часто приводит к увеличению концентрации электролитов в незамороженном внеклеточном пространстве, вызывая осмотический выход воды из клеток, что ведет к сморщиванию клеток и увеличению внеклеточного пространства (Dorge et al., 1978). Из результатов визуального наблюдения микрофотографий срезов (рисунок, см. вклейку) следует, что между клетками нет зазоров и внеклеточное пространство не увеличено. Эти наблюдения можно интерпретировать как указание на отсутствие сморщивания клеток и тканей в образцах или самого незначительного его наличия. Возможно, что все тканевые компартменты сжаты одинаково, однако такое артефакт-ное сморщивание клеток не приводит к изменению отношения сигнала к фону или к отрицательному влиянию на количественную оценку наших данных.
На рисунке 1 четко видны гранулы в ядре. Эту гранулярность связывают с образованием кристаллов льда. Образование кристаллов такого рода не влияет на перераспределение преимущественно
367
одного какого-то элемента (как обнаружили на стандартных срезах альбумина Pool и сотрудники, 1980), если область излучения находилась полностью в пределах границ отдельного кристалла льда. По этой причине размер кристаллов льда определяет минимальное пространственное разрешение, достигаемое нашим методом, и, следовательно, анализируемая область будет всегда больше, чем размер самых больших кристаллов льда. Основываясь на этих фактах, а также на данных авторадиографии о локализации растворимых веществ, полученных с помощью тех же препаративных методов (Stumpf, Roth, 1966, 1969; Brown et al., 1969), мы можем с уверенностью заключить, что в приготовленных таким образом препаратах происходит незначительное перемещение элементов.
Остается еще вопрос о том, происходит ли перераспределение элементов за период времени от умерщвления животных до замораживания ткани. Как указывалось выше, это время составляет менее 1 мин, однако, как только прекращается снабжение кровью образца, напряжение кислорода резко падает. Чтобы проверить, влияет ли этот факт на транслокацию элементов, мы сравнили внутриклеточные концентрации элементов в гепатоцитах двух крыс. Образцы клеток одного животного готовили, как описано выше. Приготовление образца клеток другого животного было следующим: целую долю печени сразу же замораживали в жидком пропане. При этом снабжение кровью оставалось интактным. Затем быстро вырезали небольшие кусочки ткани, прикрепляли их к латунному стержню и лиофилизировали. Срезы из двух образцов ткани анализировали в идентичных условиях и полученные данные статистически обрабатывали. Различий концентрации элементов в гепатоцитах, приготовленных двумя разными методами (Pool et al., 1980), не обнаружено. В связи с этим мы заключили, что в течение непродолжительного времени, требующегося для взятия ткани и ее замораживания, не происходит артефактного перераспределения элементовл способных к диффузии.
12.2.1.3. Морфологическая целостность образцов
Для приготовления и анализа образцов использовали методы, предотвращающие перемещение веществ, способных к диффузии, и давали надежные результаты о внутриклеточной концентрации элементов. Мы выбрали для образцов оптимальные условия, способствующие этой цели, и не пользовались их химической фиксацией и покрытием металлами. На рисунке (см. вклейку) представлена электронная микрофотография нормальной двенадцатиперстной кишки мышей, приготовленной для рентгеновского микроанализа, описанного в этой главе. Хотя мы не пользовались фиксацией и не покрывали ткань металлами, морфология среза оказалась качественно пригодной для идентификации разных типов клеток и дала даже некоторую внутриклеточную характеристику при малом увеличении. Гранулы больших клеток Панетта, находящихся у основания крипт, а также митотический хроматин можно четко различить от
368
интерфазных ядер энтероцитов. При увеличениях, которые используются в этом методе, можно разграничить ядрышки, ядерные мембраны, секреторные гранулы и клеточные мембраны. Мы способны также отличать кровеносные сосуды и использовать их затем как маркеры, если анализ проводили на трансформированных клетках или на срезах солидных опухолей. Анализируя лишь клетки, находящиеся в пределах ограниченного расстояния от кровеносных сосудов, мы значительно снижали вероятность включения в получаемые результаты значений, относящихся к некротическим клеткам.
12.2.2. Сравнение концентрации внутриклеточных химических элементов в нормальных и опухолевых клетках
Мы измеряли внутриклеточную концентрацию Na, Mg, Р, S, CI и К в ядрах и цитоплазме клеток четырех перевиваемых опухолей. Данные этих исследований представлены в табл. 1. В каждом случае нормальный гомолог клеток каждого типа опухоли анализировали и статистически сравнивали с опухолевыми клетками. Сравнение производили следующим образом; опухолевые клетки гепа* томы Морриса сравнивали с нормальными гепатоцитами тех же крыс; опухолевые клетки гепатомы мышей — с нормальными гепатоцитами животных-опухоленосителей и нормальными гепатоцитами животных без опухолей; клетки аденокарциномы молочной железы мышей СЗН — с нормальными эпителиальными клетками лактиру-ющей молочной железы мышей; клетки аденокарциномы молочной железы 13762NF крыс — с эпителиальными клетками лактирую-щей молочной железы крыс. Для того, чтобы определить, существует ли достоверное различие концентрации элементов в ядре и в цитоплазме, проведен статистический анализ для каждого элемента. Поскольку достоверных отличий не обнаружено, то в таблицу внесены данные лишь по определению концентрации элементов в цитоплазме. Изучение распределения Na, Са и других элементов между ядром и цитоплазмой было предметом многих работ, в каждой из которых применяли методы выделения ядер (см. обзор Siebert, 1972). В этих работах высказано предположение, что ядро является местом аккумуляции Na. Наши данные и статистический анализ не могут подтвердить это предположение и свидетельствуют о том, что Na и дру гие элементы распределены равномерно по всей клетке. Кроме того, эти данные отражают общую концентрацию элементов и не означают, что коэффициент активности различных ионов будет одинаковым во всех компартментах клетки. Понимание расхождений наших данных, полученных с помощью метода рентгеновского микроанализа и данных других авторов, выделявших ядра в условиях своих аналитических исследований, дает недавняя работа Jones и сотрудников (1979). В ней представлены доказательства, что процедура выделения ядер вызывает перераспределение элементов, в результате которого получаются ошибочно высокие значения кон* цешрации Na и Са для ядра. I
