Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
При фракционировании нуклеиновых кислот для воздействия на их плавучую плотность можно варьировать добавки соли и pH среды. Фракционирование белков в градиентах метризамида не очень удобно ввиду высокой вязкости необходимых для этой цели довольно концентрированных растворов метризамида (40—50% m/V). Особенно ценен метризамид для равновесного фракционирования нуклеопротеидов, которые в его растворах не диссоциируют и имеют небольшую плавучую плотность. Метризамид .можно использовать в щелочной среде (pH 12), когда ДНК денатурирует, и удается, например, изучать распределение белков по комплементарным нитям молекул ДНК [Russev, Tsa-nev, 1976].
Для-удаления примесей тяжелых металлов, особенно при малых концентрациях нуклеиновых кислот, растворы метризамида следует очищать на колонках «Chelex-ЮО».
Для иллюстрации возможностей использования градиентов метризамида приведем три примера.
Пример 1. Очистка мРНП из мышцы зародыша цыпленка [Bester et al., 1980]. Рибосомы и мРНП-частицы осаждали центрифугированием при 200 000 g в течение 5 ч, а затем вводили метку по белку из 14С-формальдегида в присутствии боргидрида Na. Препарат вносили в 5 мл 40%-ного раствора метризамида б 0.1 М КС1, содержащем 3 мМ MgCl2, 10 мМ р-меркаптоэтанола и 0,01 М Трис-НС1 (pH 7,4). Центрифугирование вели в бакет-роторе SW65Ti на скорости 39 000 об/мин при 4й в течение 54 ч. При этом, как видно из седиментограммы (рис. 76), градиент метризамида еще далеко не достиг равновесной формы — измерения коэффициента преломления (п2о) во фракциях (по 0,25 мл) обнаружили горизонтальную площадку в середине градиента.
Тем не менее два пика радиоактивности хорошо разделились. Более плотному пику отвечало значение р=/1,27 г/см’; как раз такое значение можно было ожидать для рибосом при относительно малом содержании Mg2+ (3 мМ). Легкая фракция располагалась на градиенте в 'положении, где пи= 1,37 и р= 1,13 г/см5. Последнее значение близко к плавучей плотности РН.К. По-видимому, мРНП-частицы в этом случае содержали мало белка.
Пример 2. Исследование плавучей плотности ДНК и хроматина печени крысы [Kondo et al., 1979].
Использовался преформированный линейный градиент 10— 60% (tn/V) метризамида при 5°
Рис. 76. Разделение рибосом (/) и
мРНП-частиц (2) из мышцы зародыша цыпленка центрифугированием в градиенте плотности метризамида [Bester et al., 1980]
Рис. 77. Изменение плавучей плотности (р) ДНК (в) и хроматина (б) в растворе метризамида в зависимости от концентрации солей [Kondo et al., 1979] ^ О 10
1—Mgci,; 2 - NaCl Дно Номер фракций
с диапазоном плотностей
-р, г/см3
1,20 и 10
0,5 1,0 О 0,5
Концентрация соли, М
1,0
1,056—1,331 г/см3. Препараты вносили на дно пробирки в 70%-ном растворе метризамида. ДНК и хроматин всплывали, а белковые примеси оставались у дна 'пробирки. Центрифугировали в роторе SW50 («Hitachi») при частоте 35 ООО об/мин. Благодаря преформированию градиента время центрифугирования можно было ограничить 12 ч. Форма градиента при этом не успевала заметно измениться. Плотность определяли рефрактометрически.
Для ДНК, растворенной в 1 мМ Трис-НС1 (pH 8), плавучая плотность р=1,13 г/см*. В присутствии солей (NaCl и MgCIs) эта плотность увеличивалась. Первоначальное снижение плотности ДНК при малых концентрациях NaCl авторы не комментируют (рис. 77, с). Возможно, что начальный этап связывания ионов Na+ с ДНК еще характеризуется такой степенью их гид-дратации, что результирующая плотность натриевой соли ДНК оказывается даже «иже, чем у ДНК в Трис-буфере. Далее, по-видимому, решающую роль играет снижение активности воды и
степени гидратации молекул ДНК за счет связывания воды при повышенной концентрации NaCl в растворе. Увеличение плот-, ности в присутствии MgCl2 естественнее всего объяснить связыванием Mg2+ с ДНК без выигрыша в степени гидратации.
Поведение хроматина в присутствии солей более сложно, так как связано еще с двумя процессами: конденсацией хроматина в солевых растворах относительно малой концентрации (5 мМ MgCl2 или 0,14 М NaCl) и диссоциацией белка от ДНК. Исходная плавучая плотность нефрагментированного хроматина в
1 мМ Трис-HCl (pH 8) составляла 1,165-г/см3 (рис. 77, б). Ход экспериментальной зависимости для MgCl2 можно объяснить сменой следующих процеосов: конденсации хроматина, диссоциации белков от ДНК и 'Присоединения Mg2+ к освобожденной от белка ДНК. Ход зависимости для NaCl обусловлен сначала конденсацией хроматина, а затем диссоциацией белков. Следует отметить, что в присутствии метризамида хроматин под влиянием соли диссоциирует заметно легче, чем без него. Так, если в 1 М водном растворе NaCl соотношение белок/ДНК в хроматине составляет 0,5—0,8, то при высокой концентрации метризамида в солевом растворе такой же крепости оно падает до 0,05. Отсюда следует, что концентрацию соли в растворе обязательно надо учитывать при сопоставлении результатов различных экспериментов, связанных с определением плавучих плотностей ДНК и хроматина в градиенте плотности метризамида.
