Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 1. Очистка высокомолекулярной ДНК из фибро-бластов человека [Waters, 1979].
Фибробласты лизировали 0,5%-ным раствором саркозила, содержащим 0,5 мМ ЭДТА и 0,2 мг/мл протеиназы К, при 37° в течение 8 ч, очень осторожно депротеииизировали фенолом при pH 8 и диализовали против буфера. В 4 мл диализата растворяли 5 г CsCl, создавая концентрацию 56,5%, чему соответствует начальная плотность р0= 1,7 г/см3. Смесь заливали в пробирку углового ротора «Spinco-40», дополняли ее маслом и центрифугировали в течение 40 ч при 37 тыс. об/мин и 20°. Собирали 30 фракций по 0,13 мл. Из каждой фракции отбирали по 10 мкл, осаждали ДНК 50%-ной ТХУ и определяли радиоактивность. Плотность раствора CsCl во фракциях определяли с помощью рефрактометра.
Проверим выбор режима центрифугирования. Плотность сухого CsCl — около 4 г/см8. Следовательно, 5 г соли занимают объем 1,25 см’. При растворении объемы можно считать практически аддитивными. Следовательно, объем градиента Кгр = = 5,25 мл. Для ротора 40 гмив=3,8 см, гмак(,= 8,1 см, а=26°. Объем пробирки =13,5 мл, ее диаметр й=1,6см. Отсюда минимальный радиус для градиента
г«тгр = 3,8 + ‘^s — + 13,5,~±25-sin 26® = 6,26 см,
2 fftl,Оа/4
а время установления градиента f=5,6 (8,1—6,26)2,= 19 ч. Очевидно, это время не лимитирует продолжительности центрифугирования.
Подсчитаем время, необходимое для миграции очищенных молекул ДНК- Ввиду специальных предосторожностей при выделении можно полагать, что s2o.w=20S. Для р0=1,7 г/см3 из табл. 3 (для CsCI при 25°) находим: = 1,14* 10е. Ориентиро-
вочно предположим, что полоса расположена посередине градиента: г= (8,1 + 6,26)/2=7,18 см. Плавучую плотность ДНК будем приближенно считать равной р0(1,7 г/см3). Подставляя указанные значения в выражение для оценки времени миграции, находим:
ulLuiliy=466
374 • 7,18» • 20
Это значение примерно соответствует использованному в опыте (40 ч). Проверим теперь возможность кристаллизации CsCI у дна пробирки:
С учетом нелинейности градиента и с запасом полагаем, что ри#Кс=Ро+0,1 = 1,8 г/см3; это заведомо меньше, чем плотность насыщенного раствора (1,91 г/см3), так что кристаллизации можно не опасаться.
Пример 2. Очистка плазмид из Agrobacter tumefaciens [Currier, Nester, 1976]. Основную массу ДНК бактерии-хозяи-на удаляли денатурацией при pH 12,2 и переводом в фенольную интерфазу в присутствии 0,5 MNaCl. Плазмидная ДНК не денатурировала и оставалась в водной фазе. Ее соосаждали с фосфатом магния, растворяли в 0,1 М ЭДТА и диализовали. Плазмидная ДНК на этой стадии была еще значительно загрязнена ДНК хозяина. Дальнейшую очистку ее вели центрифугированием в градиенте CsCI с добавлением бромистого этидия, который сильнее интеркалирует в линейную ДНК хозяина, чем в кольцевую ДНК плазмид, увеличивая различие их плавучих плотностей. К 8 мл раствора смеси ДНК в буфере добавляли 8 г CsCI и 0,6 мл раствора бромистого' этидия в воде (10 мг/мл). Таким образом, концентрация CsCI составляла 48%, чему соответствует начальная плотность раствора р0= = 1,55 г/см3. Столь малое значение р0 обусловлено снижением плавучих плотностей ДНК обоих типов (плазмидной— в меньшей степени) за счет интеркаляции бромистого этидия, конечная концентрация которого составляла 360 мкг/мл. Используя тот же угловой ротор («Spinco-40»), центрифугировали в течение 50—70 ч при 35000 об/мин и 14°. Полиалломерные пробирки прокалывали сбоку и собирали фракции, регистрируя флюоресценцию бромистого этидия при ультрафиолетовом освещении (360 нм).
Из литературы известно, что различие плотностей линейной и плазмидной ДНК вследствие интеркаляции бромистого
этидия может составлять около 0,04 г/см*. Выясним, каков был интервал плотности градиента в данном опыте, для' того чтобы сопоставить его с этим значением. Объем сухого CsCl составил 2 см3, а объем градиента Vrp=8+2+0,6= 10,6 мл. Аналогично предыдущему легко найти, что гЫЯВтр =5,14 см. Значение
р0 для CsCl п/ри р0= 1,55 г/см3 можно найти интерполяцией из табл. 3: р0= 1,195-10*. Тогда
Ар
_ 0,545 - 10* - 35* (8,1* — 5,14*)
1,195-10“
0,217 г/сма.
Это значение в 5 раз больше, чем ожидаемая разность плотностей плазмидной и хозяйской ДНК, что вполне достаточно
Рис. 71. Разделение плазмидной ДНК (/) и ДНК бактерии-хозяина (2) равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl [Currier, Nester, 1976]
Номер фракций
для хорошего разделения обоих пиков на градиенте, если рс выбрано приблизительно правильно. С другой стороны, крутизна градиента не слишком велика и различие в 0,04 г/см* позволит надежно разделить соответствующие зоны. Приведенная в работе седиментограмма подтверждает сделанный прикидочный расчет: рики отстоят друг от друга на 10 фракций, т. е. на 7б длины градиента (рис. 71). Из нее же видно, что можно было бы взять еще меньшее значение начальной плотности р0 или же уменьшить концентрацию бромистого этидия. Обычно его добавляют в концентрации 100 мкг/мл. Проверка показала, что время установления градиента ?=49ч. а время миграции плазмиды 4=30 ч. При расчете была использована константа седиментации плазмиды s20.w=36S, определенная по известной для нее молекулярной массе Af=32 -10е с помощью простой формулы s2o,w=0,0882Af°’3‘®. Однако нет уверенности, что малые обломки ДНК хозяина за время центрифугирования успеют достигнуть равновесного положения на градиенте и не будут загрязнять полосу плазмидной ДНК, поэтому в аналогичной работе [Conrad, Campbell, 1979] от низкомолекулярной ДНК предварительно избавлялись осаждением слоя препарата через 30 мл раствора CsCl плотностью 1,3 г/см3 на «подушку» с р= 1,7 г/см3. Время центрифугирования подбирали так, чтобы низкомолекулярные обломки ДНК не успевали достигнуть интерфазы.
