Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Энгельгард Х. -> "Руководство по капилярному электрофорезу" -> 122

Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.

Энгельгард Х. Руководство по капилярному электрофорезу — Москва, 1996. — 112 c.
Скачать (прямая ссылка): rukovodstvopokapilyaram1996.pdf
Предыдущая << 1 .. 116 117 118 119 120 121 < 122 > 123 124 125 126 127 128 .. 130 >> Следующая

Центрифугирование в градиенте плотности раствора CClsCOORb было использовано для- разделения денатурированной и нативной ДНК [Burke, Bauer, 1977]. Плавучая плотность денатурированной ДНК в растворе этой соли равна 1,675, а нативной—1,498 г/см3. Таким образом, разность плотностей этих ДНК составляет 0,177 г/см3, т. е. более чем в 10 раз превышает соответствующую разность в растворе CsCl (0,016 г/см3). Центрифугирование вели в роторе SW65Ti в течение 36 ч при частоте 45000 об/мин и температуре 25°. Градиент объемом 3 мл преформировали из пяти ступеней с плотностями 1,695, 1,635, 1,575, 1,515 и 1,455 г/см3. Разделение нативной и денатурированной ДНК оказалось настолько полным, что можно рассчитывать на отделение молекул с однонитевыми участками (несовершенных гибридов ДНК) от чисто двуните-вых молекул (рис. 74). Весьма вероятна также возможность отделения целых кольцевых молекул от молекул с разрывами в одной из нитей с использованием различий в их склонности к денатурации.
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ KI н Nal
К преимуществам градиентов KI и Nal относится их большая емкость, обусловленная отсутствием угрозы агрегации РНК или ДНК. В каждую пробирку ротора 50 Ti объемом 13,5 мл можно вносить до 2 мг нуклеиновой кислоты. KI не осаждается этанолом, поэтому с его помощью нуклеиновые кислоты можно переводить в осадок непосредственно из фракций градиента. Насыщающая концентрация KI составляет около 6,15 М, что соответствует плотности 1,72 г/см3. Формулы для определения плотности таковы: р25=0,6996С+1,0087; р25 = 5,8356п25 — 6,7858;
С=8,2964л25— 11,0818, где С — концентрация KI г/мл [Wolf, 1975]. Плавучая плотность ДНК в концентрированных раство-
0 J----I— t-Ll
Дно 20 itO ВО Номер фракций
Агво
1
2
Мениск
Рис. 74. Разделение нативной (2) и денатурированной (/) ДНК равновесным центрифугированием в градиенте плотности трихлорацетата рубидия [Burke, Bauer, 1977]
Рис. 75. Отделение гибрида ДНК — РНК от РНК равновесным центрифугированием в градиенте плотности KI [Cooper, Moss, 1979]
;-рнк (аН); 2 — днк (“Р)
pax KI составляет 1,51, а РНК—1,61 г/см3 [Gonzalez et al., 1978].
Ввиду сильного поглощения света растворами KI при Ж280 нм для обнаружения нуклеиновых кислот обычно применяют бромистый этидий. Для качественного обнаружения полос нуклеиновых кислот можно использовать и экстинкцию при 285 нм (в этой области длин волн поглощение раствора KI резко падает).
Перед определением радиоактивности во фракциях после центрифугирования KI желательно удалить, так как освобождающийся из него йод сильно тушит сцинтилляцию. Однако и после осаждения нуклеиновых кислот этанолом или ТХУ следы йода остаются. Фильтры с осадками можно сушить наколотыми на булавки при 80° в течение 2 ч — при этом йод улетает. Затем следует смочить фильтр 100 мкл воды и определять радиоактивность в толуол-тритоновом сцинтилляторе.
В качестве примера рассмотрим выделение мРНК, индуцируемой вирусом, путем отбора гибридов РНК — ДНК равновесным центрифугированием в градиенте KI [Cooper, Moss, 1979]. Суммарно меченную 3Н-мРНК выделяли из клеток, зараженных вирусом, а 32Р-ДНК— из вируса. Гибридизацию 32Р-ДНК и 3Н-мРНК вели в условиях образования «R-петель» (80%-ный формамид с 0,44 М NaCl при 37°), когда ДНК — РНК-гибри-дизация превалирует над реассоциацией ДНК (предварительно денатурированной). В состав гибридов с вирусной ДНК входила только вирусспецифическая мРНК, которая таким образом и отбиралась. После гибридизации 0,5 мл раствора смешивали с 4,5 мл солевого раствора, полученного растворением 55 г KI в 50 мл 0,02 М Трис-НС1 (pH 7,5), содержащего 10 мМ
б-меркаптоэтанол. Градиент KI устанавливается медленно, поэтому центрифугирование вели в роторе 50.1 при частоте 35 000 об/мин и 18° в течение трех-четырех дней. Гибрид ДНК—
РНК хорошо отделялся от основной массы 3Н-РНК (рис; 75). Для определения радиоактивности аликвоты по 20 мкл каждой фракции без переосаждения растворяли в 0,6 мл 0,15 М р-меркап* тоэтанола и добавляли 7 мл толуолтритонового сцинтиллятора. Меркаптоэтанол препятствует окислению KI и освобождению йода; сам же KI тушителем не является.
Градиенты плотности растворов Nal часто используют для разделения денатурированной и нативной ДНК. Различие плавучих плотностей этих ДНК в растворе Nal (0,035 г/см3) намного меньше, чем в случае CCI3COORb, но. все же достаточно велико для успешного их разделения. Однако в отношении емкости градиент Nal превосходит градиент CCl3COORb. Плотность раствора Nal можно оценить из соотношения: р20=5,333п25—
—6,118 (для р= 1,1 -=-1,8).
К сожалению, получить чистый препарат Nal значительно труднее, чем KI.
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ МЕТРИЗАМИДА
Ввыше была приведена структура молекулы метризамида и были отмечены основные физико-химические характеристики его водных растворов. Они не нашли применения для зональноскоростного центрифугирования, но все шире используются в режиме равновесного, поэтому здесь уместно привести более подробные данные, характеризующие растворы метризамида:
Предыдущая << 1 .. 116 117 118 119 120 121 < 122 > 123 124 125 126 127 128 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed