Руководство по капилярному электрофорезу - Энгельгард Х.
Скачать (прямая ссылка):
Наряду с бромистым этидием, в последние годы для интер-каляции в ДНК и отделения сверхскрученной плазмидной
ДНК используют йодистый пропидий Так, в недавней работе [Pettijohn, Pfenninger, 1980] равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl с начальной плотностью 1,55 г/см3 в присутствии 0,3 мг/мл йодистого пропидия надеж-* но отделяли сверхскрученную плазмидную ДНК от кольцевой, несущей единичные разрывы в одной из нитей. Центрифугирование вели в роторе Ti 50 при частоте вращения 40 тыс. об/мин в течение 48 ч при 20°.
Пр и мер 3. Разделение ДНК по (Г+Ц)-составу с помощью антибиотика дистамицина A [Tatti et al., 1978]. Этот антибиотик связывается с ДНК преимущественно по AT-6oira-тым участкам, снижая ее плавучую плотность. Эмпирическая формула для определения плавучей плотности ДНК после обработки антибиотиком в зависимости от доли общего числа оснований, приходящейся на гуанин и цитозин,— А(Г+Ц) — имеет вид: р=0,4+2,87Д (Г+Ц). Таким образом, для мыши, у которой Д (Г + Ц) =0,4, ДНК приобретает р=1,55 г/см3, в то время как у Е. coli, где Д(Г+Ц) =0,5, плотность ДНК р= = 1,83 г/см3, т. е. различие в плотностях значительно.
В цитируемой работе разделяли 3Н-ДНК Е. coli и 3*Р-ДНК из фага РМ2. Центрифугирование вели в бакет-роторе SW50.1 в объеме 2,5 мл при 36000 об/мин в течение 24 ч при 20°. Начальная плотность раствора CsCl составляла 1,63 г/см3, а рабочая концентрация дистамицина А 8 мгк/мл (esej=3,4-10* в 0,02 М NaCl). Дистамицин А после фракционирования удаляли диализом в течение ночи против 0,01 М Трис-HCl (pH 9,5)» с 1 М NaCl и 1 мМ ЭДТА.
Сходный, но менее выраженный эффект дает антибиотик нетропсин. Его рабочая концентрация равна 150 мкг/мл (еаи= =2,02.10‘).
Пример 4. Очистка ядерных РНП-частиц из эритробла-стов утки [Maundrell, Scherrer, 1979].
Из очищенных ядер РНП-частицы экстрагировали при 37® 0,01 М Трис-HCl (pH 8) с 0,1 М NaCl и 1 мМ АТФ (АТФ способствует выходу частиц из ядра). Их собирали центрифугированием при 60 000 об/мин в течение 4 ч и предварительно очищали зонально-скоростным центрифугированием в градиенте сахарозы, собирая фракцию с константой седиментации около 40S. Эту фракцию переносили в полиалломерные пробирки ротора SW 41, фиксировали добавлением глутарового альдегида до 6% в течение 1 ч при 0°, а затем смешивали с концентрированным водным раствором CsCl с таким расчетом, чтобы исходная плотность при центрифугировании составляла 1,5 г/см3, а объем смеси — 5 мл. Остальной объем пробирки (8 мл) заполняли парафиновым маслом. Центрифугирование вели при 30 000 об/мин и 25° в течение 60 ч. Собирали 30 фракций. 40 S РНП-частицы выходили острым пиком в области р =" 1,4 г/см3. Аналогичным образом исследовали плавучую плотность рибосом, а по ней определяли содержание в них белка. Рибосомы фиксировали обработкой 6%-ным раствором формальдегида.
Очень большое значение плавучей плотности РНК в растворах CsCl может быть использовано для очистки малых количеств РНК от ДНК или белков путем простого центрифугирования через некоторый объем 5,7 М CsCl (р>1,7 г/см3). Очищенная РНК садится на дно пробирки, а все остальное {ДНК, белки и др.) остается в супернатанте или над слоем концентрированного раствора CsCl [Kiper et al., 1979; Payvar, Schimke, 1979].
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ РАСТВОРОВ Cs2S04
Как следует из приведенных выше данных о плавучих плотностях, градиенты плотности растворов Cs2S04 наиболее удобны для фракционирования РНК. При использовании литературных данных следует внимательно следить за тем, как выражена концентрация Cs2S04—в массовых процентах или через отношение массы к объему (m/V). Из приведенных ниже данных видно, к какой существенной ошибке может привести подмена одного способа выражения концентрации другим (значения р даны для 25°):
Концентрация: моль/л Р, г/см* Концентрация: моль/л р, г/см*
мае. % m/V, % мае. % m/V, %
10 10,7 0,30 1,086 40 58,8 1,62 1,469
20 23,8 0,66 1,190 45 70,3 1,94 1,562
25 31,4 0,87 1,257 50 82,2 2,27 1,644
30 39,5 1,09 1,317 64 128,5 3,56 2,010
35 48,5 1,34 1,388 (насыщ.)
Плотность можно вычислить через коэффициент преломления водного раствора (при 25°) по формулам: р25= 12,120 п25— — 15,166 (для р25=1,1-М,4 г/см8; n2S= 1,340-М ,366), р25= ~ 13,699п25—17,323 (для р2,= 1,44-1,8 г/см8, n2i= 1,366-5-1,396).
Все, что было сказано о выборе, предварительном расчете и создании градиентов плотности CsCl, относится и к градиентам Cs2S04 — с учетом, разумеется, соответствующих табличных значений р0 и с поправкой на большую крутизну градиентов Cs2S04. Равновесное центрифугирование также чаще всего ведут в угловом роторе.
Неприятная особенность концентрированных растворов Cs2S04 состоит в том, что РНК в них может агрегировать и выпадать в осадок. Во избежание этого в раствор вводят мочевину (до 4 М) или диметилсульфоксид (до 10%). В этом случае анализ распределения плотности после фракционирования градиента затруднен тем, что мочевина неравномерно распределяется по градиенту, поэтому использование коэффициента преломления невозможно и приходится обращаться к прямому взвешиванию в пикнометре.
