Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
3) уменьшение относительного уровня фонового сигнала, обусловленного неспецифическим связыванием конъюгата, может достигаться также путем тщательной отмывки носителя после проведения второй стадии анализа. Так как прочность связи неспецифически адсорбированного конъюгата относительно невелика, то его отмывка должна происходить с большей скоростью и приводить к уменьшению его относительного вклада в результирующий сигнал. Однако следует учитывать, что для избежания потерь за счет диссоциации значительной части специфически связавшегося конъюгата промывки не должны быть длительными.
• Проведенное рассмотрение четырех широко используемых схем ИФА не претендует на полноту изложения, так как в качестве исходных предпосылок были взяты довольно простые приближения. Усложнение схем требует оперирования более громоздким математическим аппаратом. Целью этого раздела явилась попытка сконцентрировать внимание исследователей на моментах, прин-
254
ципиально важных для разработки и оптимизации методик анализа. Известную долю неудовлетворенности у читателей может вызывать тот факт, что оценка этих параметров проведена с использованием значений кинетических и термодинамических констант реакции антиген — антитело, значения которых в большинстве случаев неизвестны и требуют для их вычисления достаточно сложных экспериментов.
Несомненно, оптимизация любого метода ИФА может быть проведена (и в большинстве случаев проводится) чисто эмпирическим путем, так как ни одна теоретическая модель не может универсально описывать процесс взаимодействия различных молекул с антителами и учитывать множество факторов (pH, ионная сила, природа буфера и т.д.), реально на него влияющих. Но знание основных теоретических закономерностей позволяет правильно спланировать эксперимент и избежать многих ошибок при интерпретации его результатов.
Методы представления и обработки экспериментальных данных
На заключительной стадии проведения ИФА осуществляется измерение каталитической активности ферментной метки. При наличии отработанной методики анализа регистрируемый при этом параметр однозначно соответствует начальной концентрации измеряемого соединения и служит характеристикой его содержания. Единицы, в которых выражается регистрируемый сигнал, могут быть различны и зависят от метода определения ферментативной актив-сти (например, спектрофотометрический, флуориметрический, электрохимический, люминесцентный и т.д.). На основании полученных данных оператор должен сделать вывод, присутствует ли анализируемое соединение в пробе, и если да, то в какой концентрации. Этот этап является крайне ответственным, и для того чтобы максимально снизить возможность субъективных оценок результатов анализа, современные регистрирующие приборы для проведения ИФА оснащены микропроцессорами, с помощью которых рассчитывают концентрацию определяемого соединения в соответствии с заданной программой. Но пока что в большинстве случаев количественная интерпретация результатов зависит от опыта сотрудника, проводящего анализ.
Методами ИФА можно определять антигены и антитела. Методология представления результатов при этом отлична, поэтому рассмотрим эти случаи отдельно.
§ 1. Анализ результатов определения антигена
Количественную интерпретацию результатов определения антигена, как правило, проводят на основе калибровочного графика, по оси абсцисс которого откладывают концентрацию антигена в стандартном препарате, а по оси ординат — экспериментально регистрируемый в ИФА параметр. Очевидно, что правильность результатов зависит от качества стандарта и, в первую очередь, от точности определения в нем концентрации антигена.
Используемый для калибровки стандартный препарат представляет собой раствор очищенного антигена определенной концентрации в той биологической жидкости, которая подлежит анализу. В тех случаях, когда это возможно, применяемая для приготовления стандарта биологическая жидкость (например, сыворотка крови) предварительно должна быть очищена от эндогенного антигена. Способ очистки зависит от природы антигена. Многие гормоны могут быть удалены из сыворотки адсорбцией на угле. Более универсальным путем, пригодным для удаления из сыворотки любых антигенов, является иммуноадсорбция. После приготовления стандарты чаще всего лиофилизуют и хранят до использования при низкой температуре.
Стандарты бывают международные и внутренние. Внутренний стандарт может быть приготовлен в любой лаборатории. Но при этом следует помнить, что значения концентрации антигена в одном и в том же образце, измеренные в лабораториях, использующих разные внутренние стандарты, могут существенно отличаться. Для получения в разных местах сопоставимых результатов под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) утверждаются и создаются Международные стандарты, которые рассылаются в заинтересованные организации. Международный стандарт может быть получен в ограниченном количестве, поэтому при представлении такой возможности его используют для калибровки большой партии внутреннего стандарта, с которым и проводят дальнейшие исследования.
