Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 97

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 91 92 93 94 95 96 < 97 > 98 99 100 101 102 103 .. 115 >> Следующая

Рис. 46. Экспериментальная кинетическая зависимость в «сэндвич»-методе а-амилазы: по оси абсцисс — время инкубации с меченными пероксидазой антителами; по оси ординат — оптическая плотность А при Х=450 нМ продукта пероксидаз-иой реакции; концентрация антигена для кривых ) и 2 85 и 15 иг/мл соответственно
Экспериментальный график, подтверждающий возможность перегиба на кинетической кривой связывания меченых антител, приведен на рис. 46. Перегиб наблюдается на графике с высокой начальной концентрацией антигена (кривая 1) и отсутствует при низкой (кривая 2), что может быть обусловлено разной степенью заполнения антител на первой стадии анализа. Из сопоставления кривых 1 и 2 следует, что при неоптимальном времени инкубации с мечеными антителами (более 90 мин) регистрируемые сигналы при разных концентрациях антигена практически одинаковы, что
249
дает экспериментатору неверную информацию. При правильном выборе времени инкубации на второй стадии анализа («50 мин) определяемые концентрации соответствуют истинным. Следует отметить, что случай, подобный рассмотренному, наиболее вероятен при иммобилизации антител на непористых носителях, когда даже при высоких константах связывания соотношение 1/[Ат]0>/С соблюдается из-за крайне малых количеств белка на твердой фазе.
Рис. 47. Теоретическая колоколообразная калибровочная кривая в «сэндвиче-методе (о) и экспериментальный график определения а-амилазы «сэндвич»-мето-дом ИФА на полистирольных планшетах (б):
для а — [Ат]0—0.1 НМ; [Ат*)0—0,1 нМ; = с-1
Начальная концентрация меченых антител. Вторую стадию анализа целесообразно проводить в условиях, приводящих к высокой степени заполнения связанного в комплекс антигена молекулами меченых антител, что способствует достоверному выявлению низких концентраций анализируемого вещества.
Степень заполнения можно регулировать начальной концентрацией меченых молекул. На практике не следует стремиться к насыщению конъюгатом более 90% молекул связанного антигена, так как дальнейшее увеличение практически не влияет на регистрируемый «специфический сигнал», в то время как вклад неспецифических эффектов может расти пропорционально концентрации меченого соединения.
Очевидно, что для достижения высоких степеней заполнения при любых начальных концентрациях антигена концентрация меченых антител должна быть много больше [Ат]о. При работе в диапазоне концентраций меченых антител меньше [Ат]0 на кали-
250
бровочном графике при увеличении концентрации антигена может наблюдаться колоколообразная зависимость, известная в литературе под названием «хук»-эффект (англ. «hook») (рис. 47). Одной из причин наличия максимума на графике может являться блокировка меченых антител продиссоциировавшим антигеном. Если перегиб обусловлен этим, то эффект должен уменьшаться при возрастании концентрации меченых антител.
§ 4. Конкурентный метод с использованием меченых антивидовых антител
Данный подход находит широкое применение на практике, так как позволяет определять разные антигены (как моно-, так и полидетерминантные) с использованием одних и тех же меченых антител. Анализ проводят следующим образом. К иммобилизованному на носителе антигену добавляют определяемый антиген и специфические антитела. В процессе инкубации иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. В результате на носителе образуется комплекс антиген — антитело, концентрация антител в котором пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена. После удаления избытка несвязавшихся компонентов к носителю добавляют меченые ферментом антивидовые антитела, образующие комплекс со специфическими антителами. После удаления избытка меченых антител регистрируют концентрацию метки на носителе (см. схему гл. 4,§ 2).
В методе сочетаются принципы конкурентного и «сэндвич»-анализа, количественные закономерности которых рассмотрены ранее. В связи с этим, не останавливаясь на математических расчетах, ,кратко суммируем основные рекомендации для оптимизации первой и второй стадий анализа.
На первой стадии иммобилизованный и определяемый антигены конкурируют за центры связывания антител. Используя введенные ранее обозначения для данного случая [см. уравнение (9.13) ], можно записать:
[Аг]0мии=5*{[Ат]0 +Kt [кту + KKt [Ат]р2)} , (9.43)
где [Аг]0 мин — минимально определяемая концентрация антигена; Kt — константа связывания с антителами иммобилизованного антигена; [Ат]г — равновесная концентрация свободных центров связывания антител в отсутствие определяемого антигена.
Для приближения к предельной чувствительности следует выполнять условия (см. с. 230) :
251
IAt1o<4-;
A l\i Z
где В,- — равновесная концентрация антител, образующих комплекс с иммобилизованным антигеном в отсутствие определяемого антигена ([At]0=B/+[At]Jt).
Рис. 48. Влияние концентрации иммобилизованного антигена на калибровочные графики в методе ИФА с использованием меченых антивидовых антител: а — теоретические графики: для кривых / и 2 концентрация иммобилизованного антигена составляет 10 и 1 иМ; остальные условия аналогичны; [Ат]0=0,1 иМ; [Ат*]1 = 10 нМ (на-чалп^ая концентрация меченых антивидовых антител); k\ — k\* — Z 105 М—1 • с—*; ?__i=*
Предыдущая << 1 .. 91 92 93 94 95 96 < 97 > 98 99 100 101 102 103 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed