Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 98

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 115 >> Следующая

, = 4 q-1 (где и — константы скорости связывания специфических антител с . ^мобилизованным антигеном н меченых антивидовых антител с комплексом); время ии-ку^ции с конъюгатом Т=20 мин; 6 — экспериментальные графики определения тестостерона данным методом ИФА с использованием меченных пероксидазой антивидовых антител: концентрация конъюгата тестостерон — белок при адсорбции на полистирольные планшеты Для кривых J и 2 составляет 0,5 и 0,05 мкг/мл соответственно; по оси ординат — оптическая плотность продукта пероксидазной реакции
Физический смысл третьего условия состоит в том, что иммобилизованный антиген может значительно смещать равновесие реакций, проходящих в растворе (и тем самым существенно ухудшать калибровочную кривую по сравнению с кривой титрования), только в случае, если он способен связывать значительную часть антител, за которые идет конкуренция. С другой стороны, теоретически выгодное значительное снижение концентрации комплекса на носителе (В,<с[Ат]0) может приводить к трудности его детекции, осуществляемой с помощью меченых антивидовых антител, что лимитируется чувствительностью регистрации метки.
252
• При некоторых значениях К выполнение условия В;^[Ат]о/2 может достигаться изменением начальной концентрации иммобилизованного антигена или антител.
Неоптимальный выбор концентрации антигена на носителе может привести к тому, что антитела практически полностью будут связываться с ним в отсутствие определяемого антигена. В этом случае снижение концентрации иммобилизованного антигена будет существенно влиять на чувствительность анализа. Теоретически (см. уравнение (9.43)] снижение за счет этого В,- с 0,99 [Ат]0 до 0,9[Ат]0 не должно приводить к заметному изменению амплитуды калибровочной кривой, но предел обнаружения антигена может снизиться в 10 раз, благодаря изменению отношения [At]o/[At]f со 100 до 10 (рис. 48).
Степень связывания антител можно оценить экспериментально, сравнивая регистрируемый сигнал, получаемый при измерении иммобилизованного комплекса антиген — антитело после однократной инкубации и вторичного инкубирования раствора с несвязав-шимися антителами с новой дозой иммуносорбента. Если степень связывания велика, то регистрируемый сигнал во втором случае будет значительно меньше, чем в первом, что свидетельствует о необходимости снижения концентрации иммобилизованного антигена.
• Максимальная чувствительность в данной схеме достигается при проведении первой стадии в равновесном режиме. Но значительно на чувствительность влияет лишь степень приближения к равновесному состоянию реакции определяемого антигена с антителами. Так как эта реакция проходит в растворе, то скорость приближения ее к равновесию может быть значительно выше, чем процесса образования комплекса на носителе. В этом случае для сокращения времени анализа в целом целесообразно увеличивать концентрацию иммобилизованного антигена и проводить реакцию образования комплекса на твердой фазе в кинетическом режиме. Увеличение концентрации иммобилизованного антигена необходимо для образования комплекса в достаточном количестве для последующего его выявления мечеными антителами. Но при этом также следует соблюдать соотношение В,^{Ат]0/2, чтобы не допускать значительного влияния иммобилизованного компонента на реакцию антител с определяемым антигеном в растворе.
Быстрое разделение компонентов возможно в одной из модификаций данной схемы с использованием меченых специфических антител, что устраняет необходимость второй стадии и приводит к значительному сокращению длительности анализа в целом. Однако следует иметь в виду, что эффективное увеличение концентрации антигена на твердой фазе возможно не во всех случаях. Например, при использовании в качестве носителя широко распространенных планшетов и пробирок из непористого полистиро-
253
ла возможность увеличения концентрации лимитируется площадью поверхности материала.
Вторая иммунохимическая стадия анализа включает взаимодействие меченых антивидовых антител со специфическим комплексом антиген — антитело, сформированном на носителе. Основные требования к этой реакции аналогичны рассмотренной ранее второй стадии «сэндвич»-метода анализа. Очевидно, что оптимальными являются условия, обеспечивающие линейную пропорциональность между концентрациями специфических антител в комплексе (которая изменяется от нуля до значения концентрации иммобилизованного антигена) и связавшихся с ними меченых антивидовых антител при минимальном фоновом сигнале.
• Для этого можно рекомендовать следующие меры:
1) концентрацию меченых антивидовых антител следует выбирать больше концентрации иммобилизованных антител (в том числе и неспецифических, оставшихся в системе в результате отмывки после первой стадии). В противном случае на рассматриваемой зависимости может наблюдаться плато или колоколообразный эффект, что приводит к s-образной форме калибровочного графика с загибом в области малых концентраций определяемого антигена (рис. 47);
2) длительность проведения второй стадии не должна существенно превышать время достижения равновесия реакции меченых антител со специфическими антителами. Инкубация после достижения этого равновесия может привести к уменьшению регистрируемого сигнала за счет диссоциации комплекса антител с иммобилизованным антигеном, что особенно существенно в условиях, когда начальная концентрация антигена много меньше 1/К-Кроме того, неспецифическое связывание антивидового конъюгата при увеличении длительности инкубации будет возрастать, приводя к увеличению фонового сигнала;
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed