Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Егоров А.М. -> "Теория и практика имуноферментного анализа" -> 104

Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.

Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика имуноферментного анализа — М.: Высшая школа, 1991. — 288 c.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка): teoriyaimuntoferniy1991.djvu
Предыдущая << 1 .. 98 99 100 101 102 103 < 104 > 105 106 107 108 109 110 .. 115 >> Следующая

Перед измерением активности разводят 0,5 М Н202 в 34 раза холодной дистиллированной водой и смешивают с раствором 5-АС в объемном соотношении 10:1.
2. Фотометрическое определение с о-фенилендиамином. В 10 мл фосфат-ци-тратиого буфера (pH 5,0) растворяют 4 мг о-фенилендиамина и добавляют 10 мкл раствора 30%-ной перекиси водорода.
3. Хемилюминесцентное определение с люминолом. 9 мг люминола растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем до 10 мл 0,05 М трнс-НС1 буфером (pH 8,5). 9 мг л-йодфенола растворяют в 0,5 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем до 10 мл трис-HCl буфером.
Исходный 30%-ный раствор Н202 разбавляют в 1000 раз дистиллированной водой (оптическая плотность при ^,=230 нм полученного 0,01 М раствора должна быть 0,74). Для приготовления 10 мл субстратной смеси к 9,4 мл 0,05 М трис-HCl буфера (pH 8,5) добавляют по 200 мкл каждого раствора. Субстратная смесь может храниться сутки при 4°С.
§ 2. Определение антител против вируса гриппа А у людей, вакцинированных гриппозной вакциной
Знание уровня антител против вируса гриппа дает возможность контролировать качество противогриппозных вакцин, оценивать эффективность вакцинации против гриппа и, в ряде случаев, может служить диагностическим критерием заболевания. Основные результаты, положенные в основу данных методических рекомендаций, приведены в работах, посвященных разработке иммуноферментного метода определения антител против вируса гриппа А (Н. В. Бабикова и др., 1984; Т. Ю. Стерикова и др., 1986).
В основу метода положена наиболее распространенная схема определения антител, включающая адсорбцию вируса гриппа в лунках'полистнрольных планшетов, последовательную инкубацию иммобилизованного вируса с исследуемой сывороткой крови (или другим препаратом, содержащим антитела) и с меченными пероксидазой антителами против иммуноглобулинов человека и определение активности фермента в образовавшемся специфическом комплексе на носителе,
267
Реагенты, материалы и оборудование, необходимые для проведения анализа *
Очищенный препарат вируса гриппа А, конъюгат
антител против иммуноглобулинов человека с пероксидазой (АТ-ПХ), компоненты для приготовления субстратной смеси на основе 5-АС (см. § 1 этой главы), полнстирольные планшеты для ИФА, автоматические пипетки, спектрофотометр.
Выделение специфических антител против IgG человека
I. Специфические антитела против IgG человека выделяют методом аффинной хроматографии на колонке с иммуносорбентом (бромциан сефароза с иммобилизованным IgG человека).
2. Колонку (1ХЮ см) заполняют нммуносорбеитом, промывают 100 мл
0,1 М фосфатного буфера, pH 7,4, с 0,1 М NaCl (ФБ).
3. Вскрывают 3 ампулы коммерческой моноспецифнческой сыворотки, содержащей антитела к IgG-человека, растворяют содержимое каждой ампулы в 1 мл дистиллированной воды, растворы объединяют и наносят на колонку с иммуносорбентом. Раствор пропускают через иммуносорбент со скоростью ~ 1 капля в 10 с.
4. Иммунорорбент промывают ФБ с той же скоростью до исчезновения белка на выходе из колонки. Белок определяют спектрофотометрически при Я=280 нм. Общий объем буфера для промывки — 200 мл.
5. Сорбированные на колонке с иммуносорбентом специфические антитела К IgG-человека элюируют ОД М глициновым буфером, pH 2,5, с 0,1 М NaCl фракциями по 3 мл. Элюированный раствор быстро подщелачивают до нейтральных значений pH.
6. Количество белка во фракциях определяют спектрофотометрически. Фракции, содержащие максимальное количество ' белка, объединяют, диализуют против ФБ в течение 14—18 ч при 4°С.
7. Специфичность и титр выделенных специфических антител проверяют реакцией иммунопреципитацин.
8. Выделенные специфические антитела используют для получения иммуноферментного конъюгата.
Концентрацию антител (С, мг/мл) в растворе определяют спектрофотометрически при Я=280 нм по формуле С=/4г8о/1.3.
Получение конъюгата антител с пероксидазой хрена (Ат-ПХ)
1. Синтез конъюгата Ат-ПХ осуществляют перйодат-ным методом (см. гл. 7, § 2).
2. Конъюгат используют в рабочем разведении — 500 нг пероксидазы в 1 мл ТФБ. Расчет концентрации пероксидазы в конъюгате производят по формуле С=Л4оз-0,44 (мг/мл), где Лиз — оптическая плотность раствора при 403 нм.
Очистка вируса гриппа A(HzNi) и A(HiNi)
1. В работе используют вирусы А/Лен/54/1 (HiN,)P и А/Лен/385/80 (НзН2)Р, очищенные и сконцентрированные методом адсорб-
* Перечислены реагенты, материалы и оборудование, необходимое только для проведения анализа. Реагенты и оборудование для получения антител и очищенных препаратов антигенов, указаны далее в соответствующих разделах методических рекомендаций,
268
ции — элюции на формалинизированных эритроцитах и хроматографией на пористом стекле.
2. Вирусы концентрируют центрифугированием в течение 1,5 ч при 20 ООО об/мин.
3. Вирусный осадок разводят в минимальном объеме.
4. Содержащую вирус жидкость разливают порциями по 0,5 мл во флаконы и хранят при —5н—10°С.
Определение изменения уровня антител у людей,
вакцинированных гриппозной вакциной
1. В лунку полистирольного планшета вносят по 100 мкл вируса гриппа А (НзКт2) или A(HiNi), разведенного до концевой концентрации белка — 5 мкг/мл.
Предыдущая << 1 .. 98 99 100 101 102 103 < 104 > 105 106 107 108 109 110 .. 115 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed