Теория и практика имуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Стандартное отклонение. Коэффициент а, входящий в виде параметра в уравнение нормального распределения, носит название дисперсии, среднеквадратичной ошибки или стандартного отклонения.
При ограниченном наборе экспериментальных значений Xi,...,XN стандартное отклонение оценивается по формуле
Рис. 51. Кривая нормального распределения с доверительными интервалами
1
№-*„ст)2
« = \ —-, (10.2)
Г ЛГ-1 ' '
ГД6 ЗЯ -^ист берется среднее значение:
и
А'ист^Хср=-^1—. (Ю.З)
Таким образом, стандартное отклонение а имеет смысл среднего отклонения отдельного измерения от ХИст-
Стандартная ошибка. Если серии по N измерений повторить достаточное количество раз, то получаемые в каждой серии средние значения Хср будут также нормально распределены вокруг истинного значения ZHCt. Дисперсию этого распределения в отличие от стандартного отклонения называют стандартной ошибкой, она равна: SE=a) V'N, т. е. при увеличении количества измерений их среднее значение будет приближаться к истинному значению ХИСТ. Стандартная ошибка SE — среднеквадратичное отклонение .среднего значения Хср от истинного значения Хшт. При наличии ограниченной выборки (Xj,..., XN) SE вычисляется по формуле
264
/
2 ср)2
l-l
N
N(N~ 1)
(10.4)
Коэффициент вариации. Если стандартное отклонение или ошибку выразить в процентах от среднего значения ХСР, то эта величина будет называться коэффициентом вариации или относи-тельной средней квадратичной ошибкой:
Доверительный интервал. Если отложить на кривой Гаусса (см. рис. 51) по оси абсцисс -ХистгЬсТ, ХИС1+2а, ХИСт+Зст, то можно увидеть, что в интервал ХИСт±а попадает примерно 67% площади кривой, т. е. в 67 случаях из ста ошибка измерений будет меньше а, а 33 — больше. В интервалы ХИСт+2о и ХИСТ±3а попадает, соответственно, 95 и 99,7% измерений. Другими словами, если получено экспериментальное значение Хо, то с надежностью (вероятностью) 0,670 истинное значение будет лежать в интервале Xodzo, а с надежностью 0,950 и 0,997 — в интервалах Хо±2а и .ХогЬЗст.
Интервалы Zo±or, Xodt2o, Х0±3ст называют доверительными интервалами для отдельного измерения с уровнями надежности 0,670; 0,950; 0,997. Для среднего значения Хср доверительные интервалы будут равны соответственно Xcpd:(j; Xcpd:2o; XcpdzSa, однако, имея только ограниченную выборку из N значений, точное значение а определить нельзя. Поэтому доверительные интервалы расширяются из-за этой неопределенности. Доверительный интервал при определенном уровне надежности а и числе измерений N равен:
где коэффициенты приводятся в таблицах распределения Стьюдента.
• Доверительный интервал — интервал вокруг экспериментального значения, в который истинное значение попадает с заданной уровнем надежности вероятностью.
— •100%.
(Ю.5)
Методические рекомендации
В дайной главе приведены методики определения антител и некоторых антигенов наиболее широко используемыми методами ИФА. Цель раздела — дать информацию о наиболее распространенных методических подходах при проведении анализа. Следует отметить, что оптимальные условия анализа (концентрация реагентов, длительность инкубаций, время детекции ферментной метки и т. д.) должны определяться для каждого соединения индивидуально, так как они зависят от количественных закономерностей взаимодействия данного антигена с антителами.
§ 1. Приготовление основных буферных растворов для проведения ИФА и растворов субстратов для измерения ферментативной активности
1. 0,01 М фосфатный буфер (pH 7,4) с 0,1 М NaCl (ФБ). Исходные растворы: а) 1 М К2НР04Х ХЗН20 — 228 г на 1 л Н20; б) 1 М КН2РО< — 136 г на 1 л Н20.
К 40 мл раствора (а) добавляют 10 мл раствора (б) и 29 г NaCl, затем доводят объем до 5 л дистиллированной водой.
2. ФБ, содержащий 0,05% детергента твин-20 (ТФБ).
В 5 л ФБ растворяют 2,5 г твин-20.
3. 0,01 М Nа-карбонатный буфер (pH 9,6). К 13 мл 0,2 М раствора Na2C03 добавить 50 мл
0,2 М раствора NaHC03 и довести объем до 4 л дистиллированной водой.
4. 0,05 М фосфат-цитратный буфер, pH 5,0.
К 10,3 мл 0,2 М раствора Na2HP0.r2H20 добавляют 9,7 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты и доводят объем до 1 л дистиллированной водой. (0,2 М раствор готовят растворением 35,61 г Na2HP04-2H20 в 1 л Н20, а 0,1 М раствор — растворением 21,01 г лимонной кислоты в 1 л Н20)
5. 0,05 М трис-HCl буфер, pH 8,5.
К 6,05 г три-(оксиметил)-амннометана добав-
ляют 275 мл 0,1 М раствора НС1 и доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
6. 0,05 М веронал-мединаловый буфер, pH 8,6.
2,1.9 г мединала растворяют в 300 мл дистиллированной воды, затем в этот же раствор добавляют 0,35 г веронала. После полного растворения доводят объем до 1 л дистиллированной водой.
Приготовление растворов субстратов для определения пероксидазной активности
1. Фотометрическое определение с 5-аминосали-циловой кислотой (5-АС). Готовят раствор концентрацией 0,8 мг/мл путем растворения 5-АС в горячей (70°С) дистиллированной воде. Затем охлаждают раствор и доводят pH до 6,0 1 М раствором КОН. 30%-ную перекись водорода разводят в 20 раз холодной дистиллированной водой. Полученный 0,5 М раствор используют в качестве запасного и хранят при +4°С в непрозрачной пластиковой посуде.
