Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
цепь регулярно меняла свое направление, то в результате образовалась бы
структура, в которой полипептидная цепь поочередно направлена влево и
вправо, а номера остатков увеличиваются сверху вниз. Этого не наблюдается
ни в случае карбоксипептидазы А (рис. 10.8), ни у других ферментов,
исследованных к настоящему времени. Более того, в рассматриваемом случае
не представляется возможным сформировать приведенную структуру путем
последовательного свертывания цепи, начиная с одного конца, так как по
крайней мере в пяти областях не останется места для размещения
последующих фрагментов, если ранее уложенные фрагменты находятся в
надлежащем положении; кроме того, укладке последнего фрагмента будет
препятствовать дисульфидная связь, поэтому конформация цепи в про-
752
Глава 10
0
1
-C-241-N-C-240-N-C-239-
/ ' I
О \ о
/ о /
/ \ I
•204-N-C-203-N-C-202-N-C-201-N-C-200-K*
А 1 А!'
о I 0 ,
о
Рис. 10.8. Схематическое изображение структуры P-слоя карбоксипептидазы А
(КФ 3.14.17.1) [2841]. Аминокислотные остатки пронумерованы с N-конца;
пунктирными прямыми обозначены водородные связи.
I
I <Ь I о Р
II ill
-N-265-C-N-266-C-N-267-C-N-268-C-N-269-C-N-270-C-N-271-O
/о / о / О I
? \ ? \ / \ t
-190-C-N-191.C-N-192-C-N-193-C-N-194-C-N-195-C-N-196-C-\ 1 '
О I О
' I \
0 \ О \ о
1 \ I \ I
-60-C-N-61-C-N-62-C-N-63-C-N-64-C-N-65-C-H-66-
о / О / о /
' / 1 / I 1
/ р I ? ! ?
-N-104-C-N-105-C-N-106-C-N-107-C-N-108-C-N-109-
\ Ь \ о
Ь\ \ Ч 1
-53-N-C-52-N-C-51-N-C-50-N-C-49-N-I I | I >
1 9 1 9 1
I
? I ? II
-32-C-N-33-C-N-34-C-N-35-C-N-36-C-о О
цессе укладки должна отличаться в нескольких местах от ее конформации в
конечном состоянии [2841].
Структура, изображенная на рис. 10.8, выглядит плоской, однако результаты
рентгеноструктурного анализа показывают, что в действительности вся она
равномерно закручена сверху вниз, так что каждый сегмент повернут
примерно на 17° по отношению к предыдущему и суммарный угол поворота
составляет в случае карбоксипептидазы А 120°. Однако у разных ферментов
суммарный угол поворота p-структуры различен; у кар-бонат-дегидратазы, p-
слой которой образован десятью сегментами, этот угол составляет около
220° [2816], в то время как у состоящего из пяти сегментов p-слоя
субтилизина он равен ~45° [74]. Примеры закрученных p-структур можно
видеть на стереоизображениях, представленных на рис. 10.17, 10.20 и 10.25
(этот рисунок помещен на вклейке); см. также [434].
Доля остатков, находящихся в составе p-структуры, варьирует от одного
фермента к другому, но даже в молекуле карбоксипептидазы, у которой по
имеющимся данным эта доля максимальна, в состав p-структурывходит только
17% аминокислотных остатков.
Структура ферментов
753
ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА
Под третичной структурой понимают характер свертывания длинной
полипептидной цепи, приводящего к образованию глобулы; эта структура
играет фундаментальную роль в каталитической активности фермента. Она не
только определяет форму молекул фермента в целом, но и формирует активный
центр из химических групп, расположенных в разных частях цепи, и
обеспечивает определенное взаиморасположение субстратсвязы-вающих групп,
которое приводит к образованию структуры, комплементарной, молекуле
субстрата, определяя, следовательно, специфичность фермента. Когда при
денатурации молекула фермента развертывается, разрушается его активный
центр и каталитическая активность исчезает.
Определение трехмерной структуры фермента является сложным и трудоемким
делом, как это можно видеть, например, из описания процесса при
исследовании карбоксипептидазы А (Липскомб и др. [2841]). Прежде всего
необходимо получить кристаллы соответствующего размера и качества, причем
не только самого фермента, но также и ряда его производных, содержащих
атомы тяжелого металла, чтобы можно было применить метод изоморфного
замещения. Затем в каждом случае должен быть проведен рентгеноструктурный
анализ кристаллов при высоком (0,2 нм) разрешении (более низкое
разрешение, например при 0,6 нм, дает представление только об общей форме
молекулы и ничего не говорит о расположении боковых групп). Анализ может
потребовать определения параметров около 20 ООО рефлексов при
исследовании фермента и яа много тысяч рефлексов больше при исследовании
производных. Затем, произведя сложные расчеты на ЭВМ, нужно построить
карты электронных плотностей для разных сечений молекулы.
Исходя из известной аминокислотной последовательности данного фермента
строят несколько предварительных атомных моделей; сопоставив их с данными
карт электронных плотностей, получают представление о трехмерной
структуре и строят приближенную модель молекулы фермента. Затем с помощью
программы математического построения модели белков находят координаты
нескольких сотен атомов. Далее с помощью дополнительных программ,
включающих для карбоксипептидазы А расчет более 16 000 структурных
факторов, уточняют результаты. Полученные данные позволяют построить
