Ферменты 2 - Диксон М.
Скачать (прямая ссылка):
субъединиц (см. табл. 10.2). Термин "четвертичная структура" относится к
характеру укладки субъединиц; при этом рассматривается как простая
димери--зация, происходящая при увеличении концентрации фермента в
растворе (или диссоциация при разбавлении), так и образование
высокомолекулярной системы частиц, содержащей несколько разных ферментов,
- системы, структура которой может быть различима с помощью электронного
микроскопа.
Диссоциация фермента на субъединицы может происходить под действием
различных факторов - от простого разбавления раствора фермента до
действия денатурирующих агентов. Было показано, что изменение суммарного
заряда олигомера, которое можно вызвать высокой концентрацией соли или
изменением pH среды, а также химической модификацией белка также часто
приводит к диссоциации; например, сукцинилирование вызывает диссоциацию
глицеральдегидфосфатдегидрогеназы [2190], а малеилирование - диссоциацию
альдолазы из мышц кролика и из листьев шпината [3826, 4274]. Диссоциацию
может вызвать и химическая модификация сульфгидрильных групп; например,
при реакции с я-хлормеркурибензоатом диссоциируют на субъединицы
аспартат--карбамоилтрансфераза [1526] и гексокиназа дрожжей [2719]. Было
показано, что при взаимодействии метаболитов с ферментом может протекать
как диссоциация на субъединицы, так и ассоциация субъединиц, и некоторые
из этих эффектов, по-видимому, участвуют в алло-стерической регуляции
активности этих ферментов (см. гл. 8).
Структура ферментов
769
Некоторые ферменты, состоящие из субъединиц, чувствительны к низкой
температуре: при охлаждении они диссоции-. руют. Так, например, на холоду
диссоциирует пируваткарбок-силаза из печени цыплят (на четыре
субъединицы) [2144] и митохондриальная АТРаза из сердечной мышцы быка
[3645], причем инактивация, -связанная с охлаждением, не всегда обратима.
В некоторых случаях такие ферменты могут быть стабилизированы глицерином,
сахарозой или метанолом; механизм стабилизации остается неясным. Принимая
во внимание, что самопроизвольная диссоциация на холоду предполагает
выделение тепла, а это в свою очередь указывает на увеличение энтропии в
процессе ассоциации, Гутфройнд считает, что в ходе реакции полимеризации
происходит освобождение воды [1721].
Методы определения числа субъединиц в белке подробна рассмотрены в обзоре
[1423]. В тех случаях, когда процесс ассоциации легко обратим,
молекулярная масса субъединиц может быть определена путем экстраполяции
величин, полученных одним из обычных методов (таких, как определение
коэффициентов седиментации и диффузии, интенсивности светорассеяния или
осмотического давления), к нулевоой концентрации белка, однако найденная
величина может не соответствовать истинному размеру субъединицы;
например, белок оксигемо-глобин, который является тетрамером, состоящим
из двух а- и двух р-субъединиц, при разбавлении легко диссоциирует на
димеры из одной а- и одной p-цепи, и только при более жестких условиях
обработки диссоциирует на мономеры (см. [2471]).
В некоторых случаях четвертичная структура не является четко
фиксированной; например было показано, что при агрегации субъединиц
глутаматдегидрогеназы (КФ 1.4.1.3) образуется линейный стержень; степень
агрегации зависит от концентрации фермента и состава растворителя [821,
2281, 3886]. Подобный тип полимеризации может наблюдаться и в случае
глутамина-зы (КФ 3.5.1.2) :[937, 4598]. На рис. 10.26 приведена кривая
зависимости константы седиментации химотрипсина от его концентрации; при
повышении концентрации белка происходит его полимеризация. В связи с
рассмотрением ассоциирующих белковых систем следует помнить, что
концентрация белка, при которой обычно определяется ферментативная
активность, во много раз меньше концентраций, необходимых для определения
молекулярной массы или прямого определения связывания лиганда таким
методом, как равновесный диализ (гл. 4). Следовательно, степень агрегации
фермента в опытах по определению активности может отличаться от таковой
при определении его молекулярной массы или идентификации субстрат-
связывающих участков; это может приводить к противоречивым результатам,
если активность фермента зависит от степени его агрегации (см. гл. 8).
770
Глава 10
Рис. 10.26. Зависимость константы седиментации а-химотрипсина от его
концентрации для трех значений pH. Определения проводили при 25°. ф - pH
3,86, ионная сила 0,2. Д - pH 4,99, ионная сила 0,2. О - pH 6,20, ионная
сила 0,2.
Для определения молекулярной массы субъединиц используют
.ультрацентрифугирование в растворе с высокой концентрацией солей или
денатурирующих агентов. Следует помнить, однако, что измерение констант
седиментации в растворе с высокими концентрациями солей может дать
неверные результаты, так как если белок содержит воду, недоступную для
растворителя, то в солевом растворе он будет иметь большую плавучую
плотность (и отсюда меньшую константу седиментации); именно такая
