Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
8 раз смесью растворов А и Б (1:1).
Приготовленные описанным выше методом гели-образцы наносят на гелевые
колонки пипеткой (по 0,2 мл). Эта часть гелевой колонки при последующем
электрофорезе непосредственно соприкасается с
Рис. 99. Прибор для электрофореза в полиакриламидном геле: а - верхний; б
- нижний буферный резервуары.
246
электродным буфером, поэтому наслаивание заканчивают раствором
электродного буфера, разбавленного в 10 раз. Полимеризацию геля-образца
проводят при ультрафиолетовом освещении. Если тестируемый раствор
содержит сахарозу, последнюю полимеризацию не проводят. Во время
полимеризации геля-образца угольный электрод (см. рис. 96, е) закрепляют
плексигласовым держателем (см. рис. 96,ж) в центре нижнего буферного
сосуда (рис. 99, б). В последний наливают 1 л разбавленного в 10 раз
раствора электродного буфера. После 15- 20-минутной полимеризации геля-
образца (завершение процесса определяют по образованию резкой границы
раздела геля и слоя буферного раствора) стеклянные трубочки с гелем
ввинчивают в концентрически расположенные отверстия (лунки) в дне
буферного сосуда (рис. 99, а). Количество проб может быть меньше
количества лунок. В таком случае в свободные отверстия верхнего буферного
резервуара помещают пустые стеклянные трубочки таким образом, чтобы их
концы были выше уровня буферного раствора. После закрепления стеклянных
трубочек с гелем устанавливают электрод верхнего буферного сосуда.
Верхний буферный сосуд присоединяют к нижнему (см. рис. 99, б). Воздушные
пузырьки, нарушающие проводимость тока с концов трубочек, входящих в
буферный раствор нижнего сосуда, удаляют многократным обмакиванием или
встряхиванием. Заполняют верхний сосуд десятикратно разбавленным
электродным буферным раствором, к которому добавляют 1 мл красителя.
Электрофорез проводят при пониженной температуре. Время электрофореза
определяется целями исследования и в первую очередь зависит от природы
образца и концентрации геля. О положении белковых фракций и времени
электрофореза судят по положению диска красителя, молекулы которого
продвигаются вместе с подвижными белковыми ионами. В первые 0,5 ч
электрофореза сила тока не должна превышать 2 мА на каждую отдельную
трубочку (при меньшей силе тока тормозится продвижение мелких частиц
образца в раствор верхнего буферного сосуда). После того как образец
перейдет в распределительный гель, силу тока можно увеличить до 5 мА на
каждую трубочку. После окончания электрофореза трубочки с гелем вынимают
из сосуда. Гель извлекают из трубочек с помощью иголки под слоем
деминерализованной воды, помещают в красящий раствор-фиксатор, после
окрашивания промывают водой и помещают в раствор-дифференциатор.
Многократной сменой раствора вымывают краситель, не связанный с белками.
Часть геля, не содержащая белки, становится абсолютно прозрачной -
электрофореграммы можно оценивать.
При документировании электрофореграмм рекомендуется делать снимки через
слой растворителя. Электрофореграммы можно хранить в течение 1-2 мес в
пробирках, наполненных раствором-дифференциатором. Для более длительного
хранения можно высушивать гели на пластмассовом листе или стеклянной
пластинке. Гели в течение нескольких дней усыхают. В высохшем состоянии
гели могут храниться в течение нескольких лет. При помещении в раствор
уксусной кислоты гель приобретает первоначальный объем.
Щелочную буферную систему используют в основном для анализа НК и белков
кислого характера, а кислую - для анализа щелочных белков.
247
VI.2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ФРАКЦИЙ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ [115г 135, 341,
359г 472]
Мицелий многократно промывают дистиллированной водой, растирают в ступке
для получения гомогенной массы, отбирают 2-3 навески для определения
белков и абсолютно сухого вещества мицелия. Навеску мицелия (3-4 г)
помещают в ступку, многократно обрабатывают действием разной температурой
(замораживание - оттаивание), растирают, операцию продолжают до
разрушения всех клеток, затем помещают мицелий в холодильник на 20-24 ч и
центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10-15 мин. Смывают раствор белка
(альбумина), заливают новой порцией воды, центрифугируют, надосадочные
жидкости объединяют (раствор № 1). Осадки в центрифужных пробирках
заливают 25мл 10%-ной NaOH, экстрагируют глобулины в течение 20-25 ч,
центрифугируют, повторяя промывание 4-5 раз. Надосадочные жидкости
объединяют, объем измеряют (раствор №2). Осадки в центрифужных пробирках
заливают 80%-ным этанолом для экстракции проламинов, оставляют на 24 ч.
Центрифугируют, отмывают этанолом, надосадочные жидкости объединяют,
измеряют объем (раствор № 3). Осадки заливают 0,2%-ным раствором NaOH для
выделения глютелинов, оставляют на 10 ч, центрифугируют, надосадочные
жидкости объединяют (раствор № 4). По 20 мл каждого раствора отбирают (в
нескольких повторностях), помещают в колбы Кьельдаля емкостью 100 мл и
определяют белок методом Починка [349]: добавляют в колбы по 0,4 г K2S04,
