Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
раствора через бумажный фильтр определяют количество триптофана по
интенсивности окраски на ФЭКе. Чтобы удостовериться в максимальном
развитии окраски, добавляют еще несколько капель раствора нитрита натрия.
Триптофан определяют также методом Хорна [415], который позволяет
определять содержание триптофана непосредственно в навеске нативного
белка (без гидролиза). Метод заключается в следующем: к 0,5 мл раствора,
содержащего 5-7 мг белка, добавляют 1 мл воды и 0,5 мл 5%-ного раствора
и-диметиламинобепзальдегида в концентрированной НС1 и 5 мл
концентрированной HCi. Смесь сразу же приобретает розовую окраску. Через
5 мин после выдержки при комнатной температуре добавляют 1 каплю 0,2%-
лого раствора NaNO.,, смесь перемешивают и фотометрируют при ОБО нм
(после добавления нитрита проба приобретает синий цвет). Окраска
стабильна в течение часа. Количество триптофана рассчитываю! по
калибровочной кривой.
Описанный метод определения аминокислот вполне применим для определения
содержания аминокислот у микроскопических грибов, актиномицетов и других
микроорганизмов. Метод особенно удобен для получения сравнительных данных
о наличии аминокислот у микроорганизмов разных таксономических групп.
Четкое разделение аминокислот па хромаю! раммах в значительной мере
зависит от качества бумаги, чистоты употребляемых реактивов, условий
хроматографии, наличия примесей в исследуемых экстрактах и других
факторов (схема).
VI.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ [207, 467,
475, 513, 539, 560, 599, 695]
Существуют разные методы определения белка: реитгспоструктур-ный метод
определения концевых групп, ультрацептрифужпое фракционирование, метод
изотопов, электрофорез, хроматографические и оптические методы.
Ультрацентрифугированпе и электрофорез основаны на наложении силового и
электрического полей, под действием которых белки соответствующим образом
распределяются между различными участками одной фазы. Хроматографические
методы основаны на неодинаковой способности различных соединений к
адсорбции.
VI.2.1. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
В качестве адсорбента используют гидроксплапагит. Навеску (3 г)
адсорбента суспендируют в течение 5 ч с 20 мл дистиллированной воды.
Затем суспензию переносят на предварительно обезжиренную стеклянную
пластинку (7,5 X 1,5 см, юлщипа 2 мм). Перед : апссеппем адсорбента
пластинку помещают в ванночку, которую услапавлпвают па столик в
горизонтальном по иш-.ыпп!, п высушивают па воз,духе в течение суток при
комнатой температуре. Расторм белка дю более 100-200 мкг белка) наносяi
па узкую строну подсушенной пластинки на расстоянии 1,5 см от края. 1
Ьастипку с адсорбентом и белком помещают в сосуд, на дно которого
наливают элюирующий раствор - 10 мл
237
Схема качественного и количественного определения свободных
гри
238
и связанных аминокислот в мицелии и культуральной жидкости
бсв
239
фосфатною буфера (0,15 М, pH 6,8). Пластинку устанавливают под углом 75 ,
так, чтобы сторона с нанесенным белком оказалась внизу; сосуд закрывают
крышкой. Когда элюирующий фосфатный буферный расгвор, поднимаясь по
пластике с адсорбентом, достигает верхнего края пластики, се выппмаюг из
сосуда, сушат при комнатной температуре, опрыскивают 1%-иым раствором
нингидрина и проявляют [207, 559, 695].
V 1.2-2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ [661, 832]
Явление электрофореза основано на движении в электрическом поле
сравнительно небольших частиц суспензии или коллоидных растворов.
Скорость движения ионов повышается с увеличением электрического заряда с
и силы электрического поля i, однако не уменьшается с увеличением радиуса
г движущихся частичек и повышением меж-молекулярлого трения или вязкости
среды rj. Скорость движения заряженных частиц сферической формы
определяют уравнением v = = ei/Ъяп].
Препаративный и количественный электрофорез применяют соответственно для
разделения смеси веществ и их количественного определения после
разделения. Методом электрофореза удобно фракционировать антибиотики,
бактериальные антигены, белки, витамины, полисахариды, фосфорные эфиры и
другие вещества. Различают несколько видов электрофореза: зональный,
фронтальный, микроскопический и пммупофорез.
Зональный электрофорез проводят в порах твердого вещества. Этот метод
удобен благодаря простоте аппаратуры, высокой скорости и хорошему
качеству разделения, возможности разделять различные классы веществ,
способных ионизироваться в водной среде. Однако при применении этого
метода возникают некоторые трудности: адсорбция исследуемого вещества на
i рапице раздела фаз, электрофоретическое движение раствора в порах,
неоднородность поддерживающей среды.
С помощью фронтального электрофореза измеряют скорость движения границы
раздела фаз белкового раствора и его растворителей, определяют
подвижность и изоэлектрпческую точку белков с очень высокой точностью.
Метод применяют для определения гомогенности индивидуальных белков и
разделения смеси белков. Однако фронтальный электрофорез не позволяет
