Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
0,3 мл 10%-ного раствора Na2Mo04, 0,5мл 57%-ной НС104 и Змл
концентрированной H2S04. Объем раствора доводят до 50 мл водой,
взбалтывают; 20 мл раствора помещают в коническую колбу емкостью около
300 мл, добавляют одну каплю метилового оранжевого и титруют 2 н.
раствором NaOH до окрашивания жидкости в желтый цвет. Затем приливают 100
мл раствора фосфатного буфера с pH 6,7, содержащего бромистый калий;
раствор в колбе перемешивают и по стенке добавляют пипеткой 5 мл 0,12 н.
хлорамина. Накрывают колбу часовым стеклом, перемешивают в ней жидкость
круговым движением и оставляют на 25 мин. Затем добавляют 8 мл 20%-ного
раствора йодистого калия, 10 мл 8%-ного раствора щавелевой кислоты и
титруют выделившийся йод 0,02 н. раствором тиосульфата натрия в
присутствии крахмала (индикатор), добавляемого в конце титрования.
Расчет содержания белка. 1 мл 0,02 н. раствора тиосульфата натрия,
пошедшего на титрование, соответствует 0,09338 мг азота. Содержание белка
в исследуемом веществе определяют по формуле 0,09338 ТВС ¦ 100 (а - б) •
100 . 6,25 ~ нвд (100 - у) '
где X - количество белка (абсолютно сухое вещество; %); а - количество
0,02 н. раствора тиосульфата натрия, израсходованное при контрольном
титровании раствора всех реактивов без навески (мл); б - то же в
присутствии анализируемого вещества; С - объем раствора белковой фракции,
полученного при объединении надосадочных жидкостей (мл); В - объем всего
раствора, полученного после сжигания белка в колбе (мл); Т - поправка к
титру тиосульфата натрия; н - навеска мицелия (мг); в - объем всего
раствора, взятого для анализа (мл); д - объем раствора белка, взятого для
сжигания в колбе Кьельдаля (мл); 100 - для пересчета результатов анализа
в проценты;
248
100/(100 - */) - поправка на влажность; у - влажность анализируемого
вещества (%); 6,25 - коэффициент для пересчета азота в белок [707, 794].
VI.2.8. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА МЕТОДОМ ЛОУРИ
Метод основан на способности растворов белка (и некоторых аминокислот)
давать цветные реакции с реактивом Фолина.
Растворы: 0,1 н. раствор NaOH; 2%-ный раствор Na2C03 в 0,1 н. растворе
NaOH (реактив А).
0,5%-ный раствор CuS04 • 5Н20 в 1%-ном растворе виннокислого натрия или
калия (реактив В) : растворяют 10 г соли в 300 мл дистиллированной воды.
В этот раствор вносят 5 г CuS04* 5Н20 и после ее растворения доводят
объем раствора дистиллированной водой до 1 л. Перед анализом смешивают
4,9 мл реактива А с 1 мл реактива В (реактив С).
Приготовление реактива Фолина. В круглодонную колбу емкостью 2 л помещают
100 г вольфрамовокислого и 25 г молибденовокислого натрия и растворяют их
в 700 мл дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 мл 85%-ной
ортофосфорной кислоты (Н3Р04) и 100 мл концентрированной НС1. К колбе
присоединяют обратный холодильник, смесь кипятят на сетке в течение 10 ч.
После кипячения в колбу вносят 150 г сернокислого лития (Li2S04),
добавляют 50 мл дистиллированной воды и 5 капель бромной воды. Смесь
кипятят без холодильника 15 мин под тягой. Затем раствор охлаждают до
комнатной температуры, доводят его объем дистиллированной водой до 1 л,
фильтруют и хранят в темной склянке с притертой пробкой. Для определения
кислотности полученного раствора его разводят в 10 раз и титруют 0,1 н.
раствором NaOH по фенолфталеину.
Приготовление реактива Е. Готовят 1 н. реактив Фолина (например, если-
кислотность реактива Фолина равна 2,3, то для приготовления реактива Е
необходимо взять 10 мл реактива Фолина и 13 мл воды). Реактив Е можно
хранить длительное время.
Последовательность определения. Раствор белка готовят, как описано выше.
К 2 мл исследуемого раствора белка (способ приготовления раствора - см.
раздел VI.2.2.1.) добавляют 4 мл реактива С. Смесь перемешивают, через 10
мин добавляют 0,2 мл реактива Е, снова тщательно перемешивают и оставляют
пробирку при комнатной температуре на 30 мин. Интенсивность синей окраски
измеряют на спектрофотометре СФ-4 при длине волны 750 нм или на ФЭК-М с
красным светофильтром.
Расчет содержания белка. Концентрацию белка в пробе определяют по
оптической плотности раствора с помощью калибровочной кривой, которую
строят на основании оптических характеристик ряда точно приготовленных
белковых растворов нисходящей концентрации. В тех случаях, когда
необходимо получить точное представление об абсолютном содержании белка,
для построения калибровочной кривой используют кристаллические препараты
чистого белка: яичного или бычьего альбумина.
VII. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОГО ФОНДА ГРИБОВ
VII.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Нуклеотидным фондом называют качественный состав и количественное
содержание нуклеотидов, экстрагируемых тем или иным растворителем из
биомассы. В качестве растворителя обычно используют хлорную кислоту
(кислоторастворимые нуклеотиды); возможно применение и других
экстрагентов (50%-ный этиловый спирт, 5%-ный раствор мочевины).
Содержание рибонуклеотидов у грибов обычно составляет 2-6 мкмолей, или
