Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Билай В.И. -> "Методы экспериментальной микологии " -> 113

Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.

Билай В.И. Методы экспериментальной микологии — К.: Наукова думка, 1982. — 552 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiexpirementalnoymikologii1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 279 >> Следующая

количественного анализа, когда для получения воспроизводимых результатов
крайне желательно соблюдение одинаковых условий опыта при всех
определениях.
VI.1.3.3. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФРАКЦИИ СВОБОДНЫХ
АМИНОКИСЛОТ ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ
Для извлечения аминокислот из культуральной жидкости нативный раствор
выпаривают досуха в фарфоровой чашке на водяной бане. После этого
добавляют подкисленный этанол и сухой остаток тщательно
233
растирают в ступке [505]. Эту операцию повторяют трижды. Фракции собирают
вместе, фильтруют и снова выпаривают досуха. К остатку приливают 1 мл
10%-ного изопропилового спирта и экстрагируют аминокислоты. Для
хроматографии используют прозрачный раствор коричнево-бурого цвета.
Очистку экстрактов аминокислот проводят на отечественном катионите КУ-2
[396], а также на импортных ионообменниках Дауэкс-50, Зео-Карб-215 и др.
Ионообменники, или ионообменные смолы, являются синтетическими
адсорбентами, способными к обменному поглощению катионов или анионов. В
соответствии с этим все ионообменники делят на катиониты и аниониты.
Перед использованием ионообменники необходимо активировать. Для этого 5-
10 г ионообменника встряхивают в течение 1-2 ч с 200-300 мл 1 н. НС1,
после чего на фильтре отмывают от кислоты дистиллированной водой до
нейтральной реакции. В результате такой обработки катионит насыщается
Н"^-ионами. Затем ионообменник взбалтывают с водой и переносят в
хроматографическую колонку (20-25) X (1-1,5) см, в нижнюю узкую часть
которой вставляют небольшой тампон из стеклянной ваты. Необходимо
следить, чтобы в колонке между частицами ионообменника не было воздуха;
на поверхности ионообменника в колонке должен находиться слой воды или
раствора.
Полученный раствор аминокислот разбавляют водой до объема'50 мл и
пропускают через хроматографическую колонку со скоростью 1 мл/мин. При
пропускании раствора электронейтральные молекулы (сахара и пр.) и анионы
в колонке не задерживаются, аминокислоты и катионы адсорбируются
ионообменником, обмениваясь на Н^-ионы. Колонку промывают 30-40 мл
дистиллированной воды, которую затем удаляют и приступают к элюированию
аминокислот. Аминокислоты элюируют, пропуская через колонку 50 мл 6 н.
NH4OH со скоростью около 1 мл/мин. Затем колонку промывают 20-30 мл воды.
Раствор аминокислот упаривают в вакууме или на бане, добавляя 15- 20 мл
воды, и снова выпаривают для удаления следов аммиака. Выпаривание (лучше
в вакууме) проводят трижды [197, 359, 396]. После удаления воды и следов
аммиака сухой остаток аминокислот растворяют в подкисленном НС1 10%-ном
изопропиловом спирте и хроматографируют.
YI.1.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИННОГО АЗОТА
Аминный азот определяют нингидриновым методом [608]. В мерные колбочки на
50 мл к 1 мл культуральной жидкости или экстракта мицелия прибавляют 1 мл
2%-ного водного раствора нингидрина и 1 мл 10%-ного водного раствора
пиридина (перегнанного), перемешивают и ставят на 20 мин на кипящую
водяную баню. Затем пробы охлаждают, доводят дистиллированной водой до
метки и полученные образцы синего цвета колориметрируют на ФЭК-56 с
зеленым светофильтром. Содержание аминного азота рассчитывают по
калибровочной кривой, построенной по лейцину, и выражают в абсолютных
единицах на 1 мл культуральной жидкости и в относительных - на единицу
сухого вещества.
Существуют и другие методы определения аминного азота: метод Ван-Сляйка,
медный способ [359], метод титрования [743] и др.
234
VI-1 -5- ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ И ИХ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
В настоящее время хроматография на бумаге широко используется не только
для качественной идентификации различных соединений, но и для
количественного анализа. Количественное определение аминокислот основано
на измерении оптической плотности Си-производного ДИДА после вымывания
его из бумаги. Линейная зависимость между содержанием аминокислоты в
пятне и оптической плотностью раствора наблюдается при содержании
аминокислоты 0,025- 0,25 мкмолей (оптимальные концентрации 0,05-0,20
мкмоля). Точность метода ±5%.
VI.1.5.1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ
После пропускания растворителя хроматограммы высушивают в чистом вытяжном
шкафу при комнатной температуре, затем удаляют избыток растворителя и
погружают на несколько секунд в 0,5%-ный раствор нингидрина,
приготовленный по прописи, указанной в разделе VI. 1.2.7; высушивают в
темноте до исчезновения запаха уксусной кислоты. После этого
хроматограммы помещают на 15-20 мин в сушильный шкаф при температуре 60°-
80° С до полного развития окраски. Вырезают участки хроматограммы с ярко-
лиловыми пятнами аминокислот, у края хроматограммы вырезают контрольные
участки, равные по площади опытным. Вырезанные участки бумаги измельчают
ножницами и помещают в пробирки для элюирования. Элюцию проводят в водном
растворе этилового спирта (1 : 1) с добавлением 0,5 мл 0,05%-ного
раствора CuS04 в 75%-ном этиловом спирте. Лиловая окраска аминокислот
Предыдущая << 1 .. 107 108 109 110 111 112 < 113 > 114 115 116 117 118 119 .. 279 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed