Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Метод рентгеновской дифракции позволяет установить наличие бислойной структуры в природных и модельных мембранах и определить параметры бислоя. На основании анализа дифракционной картины можно исследовать состояние углеводородных цепей мембранных липидов и зарегистрировать фазовый переход из гелеобразного в жидкокристаллическое состояние. Однако из-за высокой лабильности и сравнительно малой упорядоченности структуры биомембран метод рентгеноструктурного анализа не позволяет изучить локализацию мембранных белков. Лишь в мембранах, содержащих упорядоченные белковые комплексы, удается выявить наличие и ориентацию а-спиральных участков интегральных белков.
С помощью метода дифракции нейтронов, дополняющего рентгеноструктурный анализ, определяют расположение молекул и их частей в бислое путем изотопного замещения водорода на дейтерий. В отличие от рентгеновского излучения, нейтроны практически одинаково эффективно рассеиваются легки-
ми и тяжелыми атомами. Взаимодействие с некоторыми ядрами, имеющими соответствующие резонансные уровни энергии, приводит к изменению знака амплитуды рассеяния. Амплитуда когерентного рассеяния ядром (Ь) связана с эффективным сечением (о) соотношением: Ь = л/су / 4тс. Различие в рассеянии нейтронов атомами водорода и дейтерия позволяет широко использовать эффекты изотопного замещения для изучения биомембран.
Резонансные методы анализа веществ подразделяют на метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР).
Метод ЯМР основан на резонансном поглощении в сильном внешнем магнитном поле энергии электромагнитного радиочастотного поля системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом. Он позволяет получать сведения о подвижности молекул липидов биомембран, об упаковке фосфолипид -ных молекул в бислое, используется для регистрации изменений значения pH в частицах малого размера (искусственные мембраны, митохондрии), изучать процессы латеральной диффузии липидов и трансбислойного движения (“флип-флоп”’-переходы) молекул.
Положение спектральной линии ЯМР относительно некоторой эталонной линии называют химическим сдвигом. Химический сдвиг (6) — это отношение сдвига частоты поля (Асо) к эталонному значению (со0), умноженное на 106:
5 = (Асо/со0) • 106 = ДН/Н0 • 10е,
где Ы0 — напряженность постоянного магнитного поля.
Величина 5 для алифатических протонов варьирует от -0,5 до -2,0, ароматических протонов — от -6,0 до -8,5. В качестве эталона для протонного резонанса органических соединений используют тетраметилсилан (CH3)4Si, а для водных растворов биополимеров — 2,2-диметил-2-силанпентан-5-сульфоновую кислоту |(ДСС). При высоком разрешении наблюдается сверхтонкая (мультиплетная) структура линий ЯМР, возникающая вследствие магнитного взаимодействия между ядрами, передаваемого через электроны связи (непрямое спин-спиновое взаимодействие).
К недостаткам метода ЯМР следует отнести низкую чувствительность (концентрация образца должна быть не менее 10~3 моль/л), а также малую эффективность в изучении крупных молекул, т.е. мембранных белков.
Метод ЭГЕР — это резонансное поглощение энергии электромагнитных колебаний в сантиметровом или миллиметровом диапазоне длин волн веществами, содержащими парамагнитные частицы (молекулы, атомы, ионы, свободные радикалы, слабо связанные с атомом электроны). Условие резонанса, при соблюдении которого образец поглощает электромагнитную энергию, описывают уравнением
где h — постоянная Планка; v — частота переменного электромагнитного поля; АЕ — разность энергий между магнитными подуровнями, которые образуются в результате расщепления уровней энергии парамагнитной частицы в постоянном магнитном поле Н; g — фактор расщепления (отношение магнитного момента парамагнитной частицы к ее механическому моменту (спину); р — магнетон Бора.
Метод ЭПР основан на введении в липидный бислой парамагнитных меток и зондов. Основу спиновых меток и зондов составляет стабильный свободный иминоксильный (нитроксильный) радикал с неспаренным электроном, локализованным преимущественно у атома азота:
Если производное такого радикала присоединяется к белку или липиду ковалентной связью, то такое производное называют спиновой меткой, а если с помощью электростатических сил и гидрофобных взаимодействий — то спиновым зондом.
Выбор спинового зонда или метки определяется задачами исследования. Так, для изучения характера движения липидных молекул используют липофильные спин-меченные жирные кислоты, глико- и фосфолипиды. Последние применяют также для исследования латерального фазового разделения липидов и ли-пид-белковых взаимодействий.
Некоторые амфифильные зонды, в частности 2,2,6,6-тетра-метилпиперидин-1'Г-оксил (TEMPO), растворяются частично в углеводородной зоне мембраны, а частично — в ее полярной области. Поэтому их спектры зависят от полярности окружения. Рас-
hv = АЕ = gfffi,
HgO СНа
Н3С СНз
пределение такого зонда в мембране определяется фазовым состоянием липидов и “чувствительно” к их фазовым переходам.
