Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
5.1. КРАТКИЙ ОБЗОР ГРУПП МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМЕМБРАН
Методы исследования биологических мембран весьма разнообразны и условно объединены в 5 групп: биохимические, физиологические, иммунологические, генетические, биофизические.
Биохимические методы позволяют разделять, выделять и анализировать в чистом виде липидные и белковые компоненты, изучать их физико-химические свойства в свободном состоянии и в составе надмолекулярных комплексов в условиях воздействия различных внешних факторов (температуры, концентрации водородных ионов и др.), исследовать их время «жизни», пути биосинтеза и распада этих компонентов. К ним относят методы выделения (недеструктивные и включающие разрушение клеток); разделения субклеточных фрагментов (хроматография, электрофорез, центрифугирование, иммуноаффинные методы); идентификации и оценки чистоты субклеточных фракций; выделения органелл и мембранных систем; экстракции липидов и разделения их по классам; количественного определения фосфолипидов; исследования трансмембранного распределения липидов; солюбилизации мембранных белков, их реконструкции и определения функциональной активности реконструированных мембран, выделения и модификации мембранных белков.
Физиологические методы используют для изучения функционирования естественных и искусственных мембран. Они позволяют исследовать проницаемость мембран, процессы возбуждения, торможения, проведения нервного импульса, распределения и выведения иоЬов и молекул из клеток и тканей, изменения физиологических функций клеток.
Иммунологические методы широко используются для идентификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно-блоттинг (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последующего выявления с по-
мощью антител), иммунологическая очистка субклеточных фракций, иммунологическое выделение мембранных компонентов, использование антител для отбора комплементарных ДНК, кодирующих мембранные белки.
Генетические методы основаны на использовании мутантов, дефектных по синтезу определенных мембранных белков. Они позволяют исследовать функции мембранных белков, их роль в функционировании мембран, проблемы самоорганизации мембран.
Биофизические методы позволяют изучать динамическую организацию биомембран, получить представления об упаковке и движении липидных молекул в природных и модельных мембранах, их взаимодействии друг с другом и молекулами белков, исследовать фазовые переходы и другие процессы. К ним относятся дифракционные методы (рентгеновская дифракция, дифракция нейтронов), резонансные методы, метод электронной микроскопии, оптические методы (круговой дихроизм, дисперсия оптического вращения, абсорбционная спектроскопия, люминесценция, метод флуоресцентных зондов), метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, метод моделирования и получения искусственных мембран и др.
Дифракционные методы основаны на взаимодействии электромагнитного излучения или частиц с длиной волны, соизмеримой с межатомным расстоянием, и компонентов мембраны. Их используют для определения геометрических параметров структуры: типа липидной мезофазы и ее периодичности, толщины бислоя, среднего расстояния между углеводородными цепями. К этим методам относятся рентгеновская дифракция (рентгеноструктурный анализ) и дифракция нейтронов.
В основе рентгеноструктурного анализа лежит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей с длиной волны ~ 0,1 нм. Последние рассеиваются на электронных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веществом, приводит к возникновению дифракционной картины, что позволяет зарегистрировать рентгенограмму. При рассеянии на кристалле можно рассматривать дифракцию как отражение рентгеновских лучей плоскостями кристаллической решетки. Дифракция наблюдается, если рассеянные волны находятся в фазе, т.е. разность хода лучей равна целому числу волн п.
Условие дифракции (отражения) описывает формула Брэгга—Вульфа:
пХ - 2 d sin 0,
где X — длина волны; d — расстояние между кристаллическими плоскостями; © — угол между направлением падающего луча и кристаллической плоскостью.
На основании дифракционной картины, получаемой для рентгеновских лучей с известной длиной волны, определяют параметр d. Дифракционная картина зависит от длины волны рентгеновских лучей и строения объекта. Анализ дифракционных максимумов позволяет установить распределение электронной плотности в кристалле. Рентгеноструктурный анализ дает информацию о расположении атомов в молекулах и кристаллах.
Для построения профилей электронной плотности, а также для изучения ориентации и характера упаковки углеводородных цепей используют мультислои липидов или смесей липидов и белков, ориентированные на твердой подложке. Их получают путем постепенного нанесения липидов при многократном прохождении стеклянной пластины сквозь монослой липида на границе раздела вода — воздух или путем спонтанного образования мультислоев, параллельных подложке, при испарении органического растворителя из капли липидного раствора.
