Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Иногда для достижения поставленной цели применяется метод поэтапного клонирования. На первом этапе клонируется ген метилазы. Для определения предположительной локализации рестриктазного гена проводится физическое картирование последовательностей донорной ДНК, окружающих ген метилазы. В качестве зонда для блот-гибридизации используется ген метилазы [147, 148] или
синтетические олигонуклеотиды [124]. Донорная ДНК перед лигированием обрабатывается отобранными таким образом рестриктазами с целью вырезания фрагмента предположительно содержащего не только ген метилазы, но и рестриктазы. Однако не всегда реализация такого подхода дает положительный результат. Поучителен в этом отношении пример по клонированию генов rm Dde I [124]. В этом случае на первом этапе удалось клонировать только ген метилазы. Впоследствии это нашло объяснение в том, что при получении банка генов провели исчерпывающий гидролиз донорной ДНК рестриктазой Hind III, которая как потом оказалось имеет сайт в гене рестриктазы. Для картирования генов rm Dde I методом блот-гиб-ридизации в качестве молекулярных зондов применили мети-лазный ген и смесь синтетических олигонуклеотидов, имеющих гомологию с геном рестриктазы. Структура олигонуклеотидов была предсказана на основе анализа аминокислотной последовательности N конца рестриктазы, выделенной в гомогенном состоянии из природного продуцента. В результате проведенных исследований было определено, что гены rm Dde I расположены на Pst I фрагменте хромосомной ДНК величиной 4,8 кб. Однако попытки клонировать этот фрагмент не дали
положительного результата. Он был достигнут только путем поэтапного клонирования генов метилазы и рестриктазы на совместимых плазмидах. Вынужденность использования именно такого подхода авторы, на основе полученных ими данных, объясняют тем, что в случае клонирования Pst I фрагмента, содержащего гены rm Dde I, уровень синтеза метилазы был недостаточным для защиты ДНК от действия рестриктазы. Необходимый уровень экспрессии был достигнут только в случае раздельного клонирования гена метилазы в составе фрагмента величиной 1,6 кб, вырезанного из донорной ДНК рестриктазами Hind III и Cla I, что привело к частичному удалению гена рестриктазы вместе с промотором и части m гена, кодирующей 33 С-концевых аминокислот. В случае Hind III фрагмента величиной 3 кб, содержащего интактный ген метилазы, уровень его экспрессии, как и в случае Pst I фрагмента, по неустановленным причинам был недостаточным для защиты внутриклеточной ДНК от рестриктазы. Этот пример наглядно демонстрирует, как влияние способа вырезания, так и на необходимость определенного уровня экспрессии гена метилазы для получения положительного результата в отношении клонирования рестриктазного гена.
Завершая обсуждение методов клонирования следует обратить внимание на один необычный вариант, имевший место в случае RDpn I [160]. В этом случае можно говорить о генной инженерии in vivo, реализовавшейся благодаря наличию гомологии между последовательностями фланкирующими гены rm Dpn II и г Dpn I. При трансформации Streptococcus pneumoniae— продуцента RDpn I рекомбинантной плазмидой, несущей гены rmDpn II in vivo, произошла рекомбинация с хромосомой и в результате в плазмиду перешли гены dpnC и dpnD (кассета генов Dpnl), которые заменили таким образом гены rm Dpn II (dpnM, dpnA, dpnB).
5.2. Факторы, влияющие на успешное клонирование генов гш
5,2.1. Скоординированная экспрессия
Как видно из данных, представленных в табл. 24, получено довольно большое число клонов, содержащих только ген метилазы. Объясняется это тем, что как известно система RM состоит из двух ферментов — рестриктазы и метилазы. Метилаза защищает клеточную ДНК от воздействия сопряженной рестриктазы. Поэтому в общем случае отдельно можно клонировать только ген метилазы, а в случае рестриктазы необходимо клонировать оба гена одновременно или осуществлять перенос гена рестриктазы в клетки, имеющие соответствующий модифицирующий фермент. Обычная практика осуществления экспериментов направлена на реализацию именно первого подхода. Следует отметить, что во всех исследованных случаях наб-
людалось тесное сцепление генов рестрикции-модификации. Однако, на основе имеющихся данных, было бы преждевременно утверждать, что это является общим правилом, так как используемые методы клонирования позволяют надеяться получить положительный результат только в случае удовлетворения этого условия.
Представляется, что совместное клонирование генов rm является условием необходимым, но недостаточным для положительного исхода эксперимента. После их попадания в реципи-ентную клетку встает вопрос как об экспрессии этих генов вообще, так и (в случае удовлетворения этого условия) о первоочередном проявлении защитной функции метилазы в отношении ДНК до воздействия на нее рестриктазы. Предположительно последнее реализуется путем опережающей экспрессии гена метилазы. Возможные механизмы, обеспечивающие выполнение этого условия рассмотрены в главе 9 (часть I). Формально, в случае одновременной экспрессии обоих генов rm, возможен и другой путь предотвращения гибели клетки. Для этого необходимо, чтобы метилаза опередила действие рестриктазы на субстрат. В качестве одного из возможных факторов играющего роль в опережающем проявлении активности метилазы приводятся данные о том, что рестриктазы в отличие от первого фермента являются гомомультимерными белками. Предполагается, что время необходимое для сборки субъединиц в активную форму белка в некоторых случаях может оказаться достаточным для модификации ДНК ферментом, который не обладает четвертичной структурой и сразу после его синтеза может взаимодействовать с субстратом [286].
