Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Рестрикция проявляется при трансформации или трансфекции штаммов, содержащих mcrA или тсгВ гены дикого типа плазмидами или фагами, в составе ДНК которых имеется 5-метилцитозин в специфических последовательностях [208, 227]. Такой же эффект наблюдается и в отношении рекомбинантных ДНК молекул, имеющих в своем составе экспрессирующиеся клонированные гены метилаз определенной специфичности [21, 208].
Ген тсгВ локализован на 98,5 мин генетической карты Е. coli, рядом с генами hsdR, hsdM, hsdS, обеспечивающими рестрикцию-модификацию I типа у Е. coli К-12 [210]. В той же области картирован и ген mrr, кодирующий метиладенин: специфическую рестрикцию [117]. Анализ последовательностей, узнаваемых метилазами, указывает на то, что необходимым компонентом сайта, узнаваемого системой рестрикции Мег В, являются последовательности GmC или PumC [21, 208]. McrA
МсгА и МсгВ фенотипы некоторых штаммов Е. colia>
Фенотип
Штамм
1100
АВ266
АВ1157
АТ2459
BNN93
(C600R~)6) BNN102 (С600 Hfl) С235 С600 CES200 СН734 CHI 332 СН1371 СРВ1293 ¦СРВ 1321 CR63 CRS603 2813 DH1 DH3 DH5 РМ800 ED8641 ED8654 ED8739 ED8767 ER1370 ER1381 ER1378 ER1398 ER1414 ER1451 ER1458 ER1562 ER1563 ER1564 ER1565 ES1585 GM161 GM272 СМ2163 GW1002 H680 HB101
Hfr3000 YA149
Mcr A [ Mcr В
+
+
+
+
H
+
+
+
+
+
+
H
H
H
+
+
+
H
+
+
+
+
H
H
H
+
+
+
+
H
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
H
H
+
Штамм
Hfr4000
Hfr Cavalli
HErH thi
HfrP4X6
JH132
JK268
JM83
JM101
JM107
JM107MA2
5K
K12
K802
K803
КЮ
KMBL1164 LE392 MCI 061 MM294
NM477
NM494
NM514
NM538
NM554
NM621
PA309
PC0950
Q358
RL88
RRl
SK5022
W6
W3110
W4597
WW3352
X149
Y10
Y53
Y70
Y1084
Y1088
Другие (не К-12) штаммы Е coli Е. coli В Е. coli В/г Е coli С
Фенотип Mcr А I Мег В
+
+
+
н
+
+
+
+
+
н
+
+
+
+
+
+
+
н
+
+
+
н
+
н
+
+
+
н
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
I
+
+
+
+
+
н
Н — нетестировано а)—таблица подготовлена на основе данных, приведенных в публикации [207]. б) — подчеркнуты штаммы, часто используемые в качестве реципиента в экспериментах по генной инженерии.
ограничивает ДНК, модифицированную метилазой Нра II, узнающей последовательность 5’CCGG и модифицирующей внутренний цитозин [208]. Установлено, что необходимым компонентом сайта, узнаваемого системой рестрикции mrr является последовательность GmAC или CmAG (117]. Рассмотренные системы рестрикции следует принимать во внимание в экспериментах по клонированию генов рестрикции-модификации. В таблице 25 указаны Мег А и Мег В фенотипы штаммов Е. coli. Штаммы Е. coli менее исследованы в отношении Mrr фенотипа. Однозначно его наличие определено в случае штамма НВ101 [117].
Не исключено, что описанные системы ограничения метилированной ДНК не исчерпывают возможных вариантов специфичности [207, 208]. Поэтому обсуждаемый фактор всегда следует иметь в виду при поиске причин неудачного клонирования метилаз со специфичностью, отличающейся от исследованных в отношении ограничения вариантов.
5.3. Конструирование продуцентов рестриктаз и метилаз
Клонирование генов рестрикции-модификации применяется и для получения повышения продукции этих ферментов клетками. Учитывая тот факт, что клонирование проводится в мно-гокопийные векторные плазмиды, следовало бы ожидать достижения поставленной цели за счет эффекта дозы гена. В ряде случаев это действительно наблюдалось, например, содержание рестриктаз Xba I и FnuD I в результате клонирования соответствующих генов в Е. coli в составе плазмиды равнялась 3X105 и 106 ед./г биомассы соответственно [279], что значительно превысило аналогичные показатели, характерные для исходных продуцентов X. badri и F. nucleatum. Отмечено увеличение продукции и ряда метилаз: BspR I в 3 раза [270J, Msp I в 3—4 раза [285], Dpn II в 5 раз [82]. В случае клонирования в Е. coli генов rm Pst I выход рестриктазы был близок к ее уровню в исходном штамме P. stuartii [284]. Однако, перенос рекомбинантной плазмиды, содержащей эти гены, в гомологичный хозяин (P. stuartii 164) дал 10-кратное увеличение синтеза рестриктазы Pst I, по сравнению с природным проду^ центом. Отсутствие влияния дозы гена в случае его экспрессии в гетерологичном хозяине может быть обусловлено рядом факторов: структурой промоторных последовательностей, кодон-ным составом, стабильностью иРНК и белка и т. д. (см. 9, часть I).
В ряде случаев для создания высокоэффективных продуцентов были использованы специальные приемы их конструирования. С этой целью соответствующие гены ставятся под контролем сильных промоторов. Учитывая возможное отрицательное влияние сверхсинтеза рестриктаз на жизнеспособность
клеток широко применяются индуцибельные промоторы, такие как Рь фага Я, Piacuvs, Ptac, YPhoA- С использованием методов целенаправленного конструирования рекомбинантных плазмид, созданы высокоэффективные продуценты рестриктаз PaeR7 [108], HhaH [143], Dpn II [82], EcoR I[53], EcoR V [55], Taq
