Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Янулайтис А.А. -> "Биотехнология. Том 17" -> 98

Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.

Янулайтис А.А. Биотехнология. Том 17 — Москва, 1989. — 204 c.
Скачать (прямая ссылка): fermentiserekteciiiihpremenenie1989.djvu
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 107 >> Следующая

Неудача клонирования может быть связана и с отсутствием экспрессии клонированных генов rm. Гены рестрикции— модификации выявлены в самых различных таксонах (см. разд. 2, часть I). Клонирование их осуществляется практически исключительно в кишечную палочку. Имеющиеся сведения свидетельствуют, что в Е. coli удается клонировать гены rm из представителей таксонов генетически довольно отдаленных от кишечной палочки. Однако, вопрос о том все ли эти гены экспрессируются с собственных промоторов пока до конца де исследован. Методическое решение проблемы экспрессии видится в реализации нескольких подходов. В первую очередь следует обратить внимание на то, что большое число рестриктаз выявлено в штаммах, относящихся к семейству Enterobacteria-сеа (см. гл. 2, часть I) в которое входит и Е. coli. Учитывая большое генетическое родство между представителями энтеробактерий, следует предположить и меньшую вероятность получения отрицательных результатов по клонированию в кишечную палочку за счет барьера гетерологической экспрессии.
В общем случае при выдвижении предположения о том, что возможной причиной неудачи является обсуждаемый барьер
или несксюрдинированная экспрессия генов rm, решение проблемы видится в клонировании генов метилазы и рестриктазы (вместе или поэтапно) в векторе экспрессии, содержащем перед местом вставки клонируемых фрагментов донорной ДНК про-моторные участки функционирующие в кишечной палочке.
При рассмотрении литературных данных обращает на себя внимание тот факт, что в некоторых случаях поставленная цель была достигнута путем получения с первого взгляда неоправданно больших клонотек [22, 124, 139]. Авторами публикаций этот факт никак не обсуждается. Исключение составляет pa6oJ та, посвященная клонированию генов rm Ben I i[22], где получение большой клонотеки обосновывается предположением'
о необходимости неслучайного их вырезания из хромосомы.
Первые опыты по клонированию рестриктазы Ben I в Е. coli не дали положительного результата. В ходе их выполнения удалось выделить только ген метилазы Ben I (131]. В этих экспериментах число трансформантов, учитывая величину клонируемых фрагментов и допуская тесное сцепление генов rm Ben I, было достаточным для клонирования последних в Е. coli. Отсутствие клонов, несущих оба гена, могло быть обусловлено рядом причин, в том числе и существованием определенных ограничений к способу вырезания генов rm Ben I из хромосомы, т. е. предполагалось, что совместное клонирование, экспрессирующихся в Е. coli генов рестриктазы и метилазы Ben I, Не вызывающее гибели реципиентных клеток, может реализоваться только в случае их вырезания из хромосомы определенным образом. Такое событие, очевидно, должно происходить' реже, чем случайное вырезание исследуемых генов в любом окружении. Это предположение поддавалось проверке при увеличении числа трансформантов в клонотеке. В случае В. cent-rosporus была получена клонотека, состоящая из 80 000 независимых гибридных клонов (против 2—12XJ03 в первых опытах), несущих рекомбинантные плазмиды, которые в сумме примерно в 50 раз перекрывали геном донорного штамма. Из такой большой выборки было выделено всего два клона, несущие функционирующие гены rm Ben I. Физическое картирование этих двух рекомбинантных плазмид позволило обнаружить интересный факт, заключающийся в том, что в обоих клонах точка вырезания из хромосомы В. centrosporus (продуцента rmBcn I) оказалась расположенной очень близко к гену метилазы (чего не наблюдалось со стороны гена рестриктазы,. где имелись области хромосомной ДНК разной протяженности). Если это совпадение не является случайным, то можно предположить, что совместное клонирование генов рестриктазы и метилазы Ben I в Е. coli на фрагменте, содержащем прилегающие в хромосоме В. centrosporus к гену метилазы определенные ДНК-последовательности, по каким-то причинам является невозможным. Это может быть обусловлено, например, неста-
бильностью рекомбинантных плазмид или несогласованной экспрессией рестриктазы и метилазы, опосредованных обсуждаемыми, прилегающими к гену метилазы Ben I последовательностями ДНК, проявляющими эту свою «функцию» в новом для них окружении — в клетках Е. coli в составе рекомбинантной молекулы. В случае MDde I необходимый уровень экспрессии был достигнут тоже только в случае ее клонирования в определенным образом вырезанном фрагменте ДНК [124].
Таким образом, не исключено, что для клонирования генов рестрикции-модификации, по меньшей мере в некоторых случаях, необходимо их вырезание из исходной ДНК в соответствующем окружении. Необходимость выполнения этого требования несомненно должна значительно снизить вероятность успешного клонирования таких генов и связана с необходимостью получения больших клонотек, желательно на основе фрагментов клонируемой ДНК, полученных путем ее расщепления наиболее случайным образом.
5.2.2. Ограничение модифицированной ДНК
Довольно неожиданным было недавнее открытие еще одного барьера для клонирования генов rm, связанного с наличием у Е. coli штаммо-специфических метилцйтозин и метил-аденин-специфических систем рестрикции. Имеется в виду системы, влияющие на перенос в клетки ДНК, содержащей 5-метилцитозин и 6-метиладенин в специфических последовательностях [117, 208]. Давно было известно, что Е. coli ограничивает ДНК, содержащую необычно модифицированный цитозин — 5-гидроксиметилцитозин. Этот феномен контролируется генами rglA и rglB [168, 215]. Оказалось, что рестрикция 5-метилцитозин, содержащей ДНК, обусловлена этими же генами, получившими в последнем случае название mcrA (rglA) и тсгВ. (rglB) [206, 208, 226].
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 107 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed