Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
может необратимо адсорбироваться на электроде, предотвращая таким образом
дальнейший перенос электрона. Во-вторых, подход к электроактивному центру
может быть стерически затруднен, что делает невозможным контакт с
поверхностью электрода. И, в-третьих,
142
Глава II
как отмечено выше, малые токи могут быть обусловлены низким коэффициентом
диффузии макромолекул. Стратегия разработки методов прямого
амперометрического определения белков должна быть нацелена на первые две
проблемы.
Есть все основания считать, что в сильном (104-105 В/см) электрическом
поле на границе электрод/раствор молекулярная структура белка-
полиэлектролита существенно меняется, иногда вплоть до частичной или
полной денатурации. Уменьшение заряда белка или поверхности электрода,
очевидно, должно понижать энергию такого взаимодействия. Исходя из этих
предположений, Армстронг и др. [8] добавляли Mg2 + в раствор ферредоксина
из Clostridium pasteurianum, получая обратимую волну. По-видимому,
образование ионных пар между Mg2+ и отрицательно заряженным белком
понижает общий эффективный заряд молекулы. Аналогичные результаты
получены для пластоцианина [9]. В 1979 г. группа исследователей из
Оксфорда [22] показала, что электрод можно модифицировать, адсорбируя на
нем 4,4'-дипиридил. На таком электроде цитохром с реагирует почти
обратимо. В последующих работах [3] было показано, что адсорбция белка на
электроде обязательно должна происходить раньше, чем перенос электрона. В
данном случае адсорбция протекает быстро и обратимо, что, очевидно,
связано с модификацией электрода дипиридилом. Сам дипиридил при
потенциале восстановления белка неэлектроактивен. Еще одним примером
может служить цитохром с3 (из Desulfovibrio vulgaris) [35, 50, 51]. Этот
четырехгемовый белок необратимо адсорбируется на "голом" электроде,
модифицируя его таким образом, что перенос электрона становится быстрым и
обратимым. Примеров быстрого непосредственного переноса электрона с
участием белков известно немного. Поэтому использование медиаторов
представляется наиболее перспективным подходом до тех пор, пока
отсутствуют подходящие стабильные модифицированные электроды.
Несколько лет назад было установлено, что для сопряжения биологических
ре-докс-пар с электродом можно использовать электрохимически генерируемые
низкомолекулярные соединения [40, 59]. Медиатор служит для облегчения
выгодного термодинамически, но затрудненного кинетически переноса
электрона. Действие медиатора иллюстрирует следующая схема:
М0 + е" MR Электрохимическая реакция (11-6)
В0 + е~ -> BR Электрохимическая (очень медленная) реакция (11.7)
MR + В0 -> М0 + BR Химическая реакция (11.8)
Здесь М0, MR и В0, BR-соответственно окисленные и восстановленные
формы
медиатора и биологического материала. Электрохимический процесс протекает
при потенциале восстановления медиатора. При этом значении потенциала
реакция (11.7) происходила бы и в отсутствие медиатора, если бы кинетика
гетерогенного переноса электрона была более благоприятной. Поскольку в
результате реакции (11.8) М0 генерируется вблизи поверхности электрода,
ему не требуется диффундировать далеко, чтобы снова вступить в реакцию
переноса электрона. Следовательно, в случае быстрой химической реакции
значительное усиление тока может наблюдаться даже в присутствии
небольшого количества В0. Регистрируемый ток непосредственно связан с
концентрацией В0, что широко используют в электроаналитических методах.
Реакции электрохимически генерированного MR не слишком специфичны,
поэтому недопустимо присутствие окислителей, которые могут конкурировать
с В0. В принципе медиатор можно иммобилизовать на поверхности электрода
или удерживать в примыкающем к ней слое.
При разработке биосенсоров, особенно на основе катализируемых ферментами
окислительно-восстановительных реакций, имеет смысл использовать электрод
как своего рода кофактор. Примером может служить хорошо изученная
система, содержа-
Принципы работы амперометрических сенсоров
143
щая глюкозооксидазу:
P-D-глюкоза + Е0 -> глюконовая кислота + Ек (11-9)
ER + С0 -" Е0 + CR (11.10)
где Е0, Ец и С0, CR соответственно окисленная и восстановленная формы
фермента и кофактора. В гомогенном растворе С0-это обычно кислород, a CR-
пероксид водорода. Цель иммобилизации фермента в биосенсоре состоит,
конечно, в том, чтобы получить амперометрический отклик, пропорциональный
концентрации глюкозы. Чтобы это условие выполнялось, скорость всего
процесса должна лимитироваться реакцией (11.9). Показано (7hevenot D. R.,
неопубликованные данные, 1985), что колебания уровня С0 (кислород) в
окружающей среде могут существенно влиять на отклик сенсора при
измерениях как in vivo, так и in vitro. Если бы белок Ек быстро окислялся
непосредственно на электроде, то колебания концентрации кислорода не
составляли бы проблемы. Хотя есть некоторые данные о том, что
глюкозооксидаза окисляется на электроде [21, 38], в целом скорость этого
