Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
дает воспроизводимого сигнала после продолжительной (в течение нескольких
часов) выдержки в растворах белков. Чаще всего с помощью
амперометрических биосенсоров определяют кислород, используя для этой
цели электрод Кларка [15]. Пионерские работы Адамса [1, 2] послужили
импульсом для развития методов контроля in vivo катехоламинов и других
важных нейроактивных веществ. Электроды, регистрирующие сигналы
нейротрансмиттеров в хвостатом ядре мозга крысы, должны не только
обеспечивать быстрый отклик, но и быть настолько миниатюрными, чтобы было
возможно пространственное разрешение исследуемых процессов. Уайтман и
сотр. [37, 43] разработали ряд микроэлектродных датчиков из углеродного
волокна и Pt или Au проволоки. Диаметр электродов составляет менее 0,5
мкм. Такая малая площадь поверхности электрода позволяет, как правило,
измерять токи в наноампер-ном диапазоне. Поскольку отношение
характеристической площади поверхности электрода к толщине диффузионного
слоя мало, вольтамперометрический сигнал микро-
Принципы работы амперометрических сенсоров
145
электродов существенно отличается от сигнала больших электродов.
Поскольку измеряемые токи малы, эти электроды удобно использовать в
циклической вольтампе-ромегрии с высокими скоростями развертки (103-104
В/с). При введении в живую ткань такой электрод анализирует
непосредственно окружающую его жидкость.
Другая исключительно важная конфигурация - это проточный
амперометрический детектор. Наиболее часто используют устройство,
состоящее из тонкослойной ячейки с плоским электродом из Pt, Au или
стеклоуглерода. Противоэлектрод и электрод сравнения располагают по
течению потока. В этом случае сопротивление ячейки может быть довольно
велико, но токи опять-таки лежат в наноамперном диапазоне, поэтому /Л-
потер и обычно незначительны. Такую систему успешно и широко используют в
качестве детектора в жидкостной хроматографии [42]; сообщалось о пределах
обнаружения в несколько пикомолей [48]. Проведены фундаментальные
исследования электродов этого типа с целью оптимизации их отклика [32,
63]. Проточные датчики используют прежде всего для отбора проб in vitro,
часто в сочетании с очисткой и хроматографическим разделением пробы.
Тевено и сотр. продемонстрировали применение такого ферментного электрода
совместно с экстракорпоральным шунтом для контроля за концентрацией
глюкозы в крови в масштабе реального времени (гл. 22). Обычно проточный
детектор работает при постоянном потенциале, хотя в некоторых случаях
возможен и сканирующий режим. Тонкослойный детектор представляет собой
своего рода проточный реактор. Для селективного превращения или
мониторинга частиц, исходно имеющихся в пробе или генерируемых
электрохимически в детекторе, можно использовать комбинации электродов с
различными потенциалами [53]. Сигнал детектора зависит от скорости
потока, поэтому последнюю необходимо тщательно контролировать, особенно
при низких пределах обнаружения. Работа насоса, прокачивающего раствор,
вызывает периодические колебания уровня сигнала. При обычных скоростях
потока электролизу подвергается 10-20% всего электрохимически активного
материала, проходящего через детектор. Обычно это приводит к появлению
острого пика, высоту или площадь которого можно использовать в расчетах
при количественном определении веществ.
По чувствительности и селективности амперометрическое детектирование
вполне соответствует требованиям иммуноанализа. Этот вопрос обсуждается в
опубликованном недавно обзоре [34]. Прямое электрохимическое определение
антитела обычно невозможно, поэтому к антителу или антигену (гаптену)
пришивают электрохимически активную метку. Чаще, однако, в
иммуноферментном анализе находят активность фермента, определяя
концентрацию в растворе электроактивного продукта катализируемой
ферментом реакции. Поскольку в расчете на один моль фермента может
получаться за разумное время по меньшей мере 103- Ю4 моль продукта, имеет
место своего рода усиление. Соответственно возможно определение
концентраций на уровне ниже пикомоль. Описано применение данного метода
для определения поверхностного антигена вируса гепатита В [12], кислого
a,-i ликопротсина [18] и фенитоина [24]. В работе [17] фемтомольные
количества IgG определяли in situ в потоке через иммуно-реакторную
систему с погрешностью + 3% менее чем за 30 мин.
Чувствительность иммуноферментного анализа существенно повышается, если
располагать иммуносорбент как можно ближе к амперометрическому сенсору. К
сожалению, большинство иммунохимических реакций имеют такие высокие
константы равновесия, что трудно разрушить однажды образовавшийся
комплекс антитело-антиген. Икарияма и сотр. [39] разработали удобную
систему для вытеснения ферментной метки с электрода, покрытого мембраной,
в результате чего высокоаффинная реакция протекает в растворе, а не на
поверхности сенсора. Тем не менее иммуносен-сорные поверхности, дающие
быстрый и воспроизводимый отклик, встречаются довольно редко.
