Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
и катион N-метилфеназиния (NMP+).
Известен и более простой и к тому же прямой способ, не требующий
медиатора, но для этого необходим такой материал электрода, на котором
может непосредственно окисляться восстановленный фермент:
Глюкоза + GOD/FAD -> глюконолактон + GOD/FADH2 На электроде: GOD/FADH2 ->
GOD/FAD + 2Н+ + 2е
Эта схема реакции является самой простой из всех возможных. Она
использована в приборах третьего поколения, описанных в недавно
опубликованных работах [2, 7]. Кулис и сотр. [14, 22] установили, что для
окисления фермента можно использовать
150
Глава 12
органические проводящие соли типа NMP+TCNQ (см. также гл. 15):
СН3 NC CN
NC-
OS
NMP+
TCNQ
При разработке ферментных электродов важно идентифицировать
скоростьопреде-ляющую стадию, от которой зависит эффективность работы
всего прибора. Такой стадией может быть перенос субстрата через мембрану,
реакция его с ферментом, перенос продукта реакции обратно через мембрану
или регенерация фермента. Исходя из этого, мы начали с разработки модели
ферментного электрода. Поскольку в основе электродов третьего поколения
лежит самая простая схема реакций, мы построили модель электрода именно
этого типа (к тому же так удастся избежать излишних математических
вычислений). Затем этот подход можно распространить на электроды второго
поколения. Ниже также показано, как определить лимитирующую стадию по
экспериментальным данным.
12.2. Модель ферментного электрода
На рис. 12.1 схематически показано устройство ферментного электрода
третьего поколения. Что касается кинетики ферментативной реакции, мы
исходили из предположения, что в реакции участвует один субстрат, один
продукт и фермент. При этом фермент Е превращает субстрат S в продукт Р,
а сам превращается в Е':
к 1 к-) к ¦>
S + Е 4 ES ^ Е'Р 4 Е' + Р.
к_ 3 к__ 2 к _ з
1
Электролит
Электрод
(So) 5
Р (Ро)
Мембрана
(Soo) S
Р (Poo)
Внешняя
среда
Рис, 12.1. Схематическое изображение ферментного электрода.
Амперометрические ферментные электроды
151
Для каждой стадии в этой схеме можно записать
Кп = kjk_n
где KJD описывает суммарное равновесие между S + Е и Р + Е'.
Перенос S и Р через мембрану описывается константами скоростей
массопереноса [1] k's и кр (в общем виде кх, где Х-либо S, либо Р):
Здесь Dx - коэффициент диффузии; Кх коэффициент распределения X в
мембране;
-толщина мембраны. Предполагается, что электродная реакция, описываемая
константой /с', является необратимой. Все константы скоростей с индексом
' относятся к гетерогенным реакциям и выражаются обычно в см-с-1.
Строчными буквами обозначены концентрации различных частиц, причем для S
и Р индексы со и О обозначают концентрации с наружной и внутренней
стороны мембраны соответственно. Мы полагаем, что слой электролита за
мембраной настолько тонок (толщиной в несколько микрон), что в нем
отсутствует концентрационная поляризация. На практике именно этот случай
встречается чаще всего. Эффекты концентрационной поляризации рассмотрены
нами ранее [3].
12.3. Уравнение стационарного состояния
В стационарном состоянии поток j (обычно выраженный в моль см_2 с -1)
можно записать следующим образом:
Исключая из уравнений (12.1) - (12.7) шесть неизвестных (л", р0 и четыре
концентрации фермента), получаем
kx - Dx KX/LM.
j = k'$(sCB - .s0)
= L [_kl s0 e - k_ j as]
= L[k2es - k_2 e' p]
= L[k3e'p - k_3pxe'] = k'p(pQ -paj)
= k' e'.
(12.1)
(12.2.)
(12.3)
(12.4)
(12.5)
(12.6)
Общую концентрацию фермента e% можно выразить как
cj; = е + as + е' р + е'.
(12.7)
152
Глава 12
К.
+
К1к2 К1К2къ
(12.10)
Выражения для кКШ и Км//скат обсуждались в работе [6]. На диаграмме,
приведенной на рис. 12.2, показан вклад каждого члена в уравнениях (12.8)
и (12.10) в возможное изменение свободной энергии на всех стадиях
процесса. Благодаря тому, что почти все константы равновесия и скорости
отдельных процессов входят в уравнения (12.8) - (12.10) в виде обратных
величин, оказывается возможным выделить различные лимитирующие скорость
процессы [6]. Ниже обсуждаются отдельные члены уравнения (12.8).
Во-первых, имеется два члена, включающие L. Они могут доминировать,
только если лимитирующим процессом является ферментативная реакция.
Первый из этих членов, включающий /скат, соответствует насыщению
фермента, а второй член с
Рис. 12.2. Схематическая диаграмма, показывающая разности свободных
энергий, которые соответствуют каждому из десяти скоростьопределяющих
членов уравнений (12.8) - (12.10). Три члена, составляющие fcKilT
[уравнение (12.9)], обведены кружками, а три члена, составляющие кШТ/Км
[уравнение (12.10) ],-прямоугольниками. Комбинация четырех констант в
нижнем ряду (реакция Е + SJ составляет член i'x. в уравнении (12.8).
Остальные комбинации констант входят в первый член уравнения (12.8).
Амперометрические ферментные электроды
153
Км/кк11 ненасыщенному ферменту. Если поток / становится близок к пределу,
ограничиваемому транспортом через мембрану (j & k'ssx), то вследствие
