Биосенсоры: основы и приложения - Тёрнер Э.
Скачать (прямая ссылка):
потенциометрического сигнала, обуславливаемого изменениями концентрации
определяемого компонента. Упомянутые системы изучены экспериментально,
однако ни одна из них еще не нашла практического применения.
Из приведенных выше примеров наиболее хорошо изучена, по-видимому,
глюкозо-оксидазная редокс-электродная система [3, 10-12]. Глюкозооксидаза
катализирует реакцию между [З-О-глюкозой и 02 с образованием
глюконолактона и пероксида водорода. Как отмечено во введении, в
биокаталитических ферментных редокс-элект-родных системах
оксидоредуктазный фермент иммобилизован на поверхности электрода, а
определяемое вещество находится в растворе. Другие редокс-системы могут
включать: 1) иммобилизацию кофактора фермента, например порфирина или
флавина, на поверхности электрода в расчете на то, что содержащиеся в
пробе апоферменты смогут катализировать окисление или восстановление
иммобилизованных редокс-цент-ров; 2) иммобилизацию фермента и медиатора
на поверхности электрода. Работая с глюкозооксидазой, мы иммобилизовали
фермент на электроде из благородного металла или углерода.
Предполагается, что потенциал этих электродов зависит от концентрации
глюкозы, кислорода и пероксида водорода в растворе, а также наличия
функциональных групп на поверхности платины или углерода. Ниже приведена
методика и результаты работы с глюкозооксидазным редокс-электродом.
Глюкозооксидазу (в чистом виде или в смеси с каталазой) иммобилизуют на
платине, пористом графите или золоте. Такая система дает непосредственный
потенциометрический сигнал в растворах глюкозы при pH 7,4. Методика
приготовления может быть, например, следующей. В буферном растворе
фосфата натрия (pH 7,4) смешивают каталазу, лиофилизованную
глюкозооксидазу из A. niger, бычий сывороточный альбумин и глутаровый
альдегид. Смесь выливают в формочку, в которой находится диск из
платиновой фольги толщиной 0,05 мм. Толщину поперечно-сшитой фермент-
альбуминовой матрицы можно менять с помощью прокладок на дне формы,
например от 0,05 до 0,32 см. При комнатной температуре сшивка белков
глутаровым альдегидом длится 2 ч. Перед проверкой ферментативной
активности или потенциометрическими измерениями сшитый глутаровым
альдегидом слой отмывают буферным раствором в течение 1-2 дней, чтобы
удалить слабосвязанный фермент [11].
Сшитый фермент-альбуминовый слой толщиной 0,32 см содержит около 8 мкг
глюкозооксидазы (приблизительно 0,8 ед. активности). Как обычно,
кажущуюся активность иммобилизованного фермента можно определить
фотометрически с о-диа-низидином и пероксидазой, используя глюкозу и
кислород в качестве субстратов. В данном случае она составляет всего
0,0044 ед., или менее 1% ожидаемой для 8 мкг глюкозооксидазы активности.
Такое низкое значение объясняется диффузионными ограничениями,
налагаемыми сшитым носителем. Следовательно, можно ожидать, что
активность глюкозооксидазы будет обратно пропорциональна толщине сшитого
фер-мент-альбуминового слоя.
При прямых потенциометрических измерениях глюкозооксидазный электрод и
Ag/AgCl электрод сравнения погружают в насыщенный кислородом раствор
глюкозы, pH которого поддерживают в пределах от 6,0 + 0,1 до 7,5 + 0,1 с
помощью 0,1 М буферного раствора фосфата натрия. Потенциалы можно
измерять любым подходящим потенциометром, например Keithley 6 ЮС. На рис.
10.4 приведены типичные результаты для ферментного слоя различной
толщины, нанесенного на одну сторону платинового диска. При удалении
покрытого ферментом платинового диска из формочки ферментный слой
получается очень тонким (~ 0,02 см). Если же диск находится в формочке,
толщина ферментного слоя составляет 0,05-0,24 см. Как видно
Потенциометрические биосенсоры
135
Рис. 10.4. Потенциометрический отклик глюкозо-оксидазного платинового
электрода в насыщенном кислородом растворе глюкозы при pH 7,4 (0,1 М
буферный раствор фосфата натрия). Потенциалы рассчитывали как разность
измеренных и фоновых значений (без глюкозы). Электрод сравнения -Ag/AgCl
(в 1 М КС1). Кривые проведены с помощью метода наименьших квадратов. 1,
2-покрытый ферментным слоем платиновый диск, извлеченный из ванночки; 3-
5-платиновый диск с толщиной ферментного слоя 0,05 (3), 0,16 (4) и 0,24
см (5) (измерения проводили, не извлекая диск из ванны).
из рис. 10.4, зависимость является нернстовскои при концентрациях глюкозы
5и ; 400 мг/100 мл. Это представляет интерес для клинического
определения глюкозы,
; поскольку нормальный уровень содержания глюкозы в крови находится в
интервале
j 90-120 мг/100 мл.
Аналогичные линейные зависимости наблюдаются и при нанесении глюкозоокси-
дазного слоя на пористый графит вместо платины (рис. 10.5). Однако при
этом график ; зависимости потенциала от логарифма концентрации глюкозы
имеет положительный,
а не отрицательный наклон, как в случае платинового электрода [12].
Рассмотрим ! возможные механизмы возникновения потенциометрического
сигнала для этих двух
[ случаев (детально они обсуждаются в работах [3, 12]).
