Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Незадолго до выяснения пространственной структуры РНК-полимеразы нами была предложена модель транскрипционного комплекса на стадии элонгации, которая подвела основные итоги нашей многолетней работы по исследованию химических сшивок и мутантных РНК-полимераз и послужила отправной точкой для построения молекулярных моделей, основанных на данных ретгеноструктурного анализа. Центральным элементом этой (как и всех предшествующих) модели является гибрид между матричной нитью ДНК и растущей нитью РНК-продукта (Yager et al., 1991). Многие годы шли споры относительно длины (от 2 до 12 н.п.) этого гибрида и о его роли в определении стабильности элонгационного комплекса. Наши данные продемонстрировали, что эта длина составляет около 8 н.п. (Korzheva, 1998). Модель включает следующие элементы нуклеинового каркаса: передний и задний (относительно хода транскрипции) ДНК-дуплексы длиной примерно 10 н.п. каждый, РНК-ДНК-гибрид (гетеродуплекс) длиной 8-9 н.п., неспаренную нематричную нить ДНК длиной около 12 н. и неспаренную нить РНК позади гетеродуплекса. Предполагается, что все узлы описанного выше нуклеинового каркаса фиксируются специфическими контактами с РНК-полимеразой. Замки, фиксирующие узлы этого каркаса, должны обеспечивать не только его высокую прочность, но и способность РНК-полиме-
117
разы легко скользить относительно нуклеиновых кислот, обеспечивая расплетание и заплетание гетеро- и гомодуплексов. Поверхностным описанием этих устройств может служить аналогия с застежкой “молнией”.
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ МОДЕЛЬ
ЭЛОНГАЦИОННОГО КОМПЛЕКСА
Рентгеноструктурные работы открыли недоступные ранее возможности исследования структуры и функций РНК-полимераз, в частности для анализа структур низкого разрешения, видимых под электронным микроскопом (Finn et al., 2000), а также для интерпретации данных по контактам РНК-полимеразы с ДНК-матрицей и ГНК-продуктом, полученных методом химических сшивок. Рассмотрение структуры показало, что все наши ранее опубликованные предсказания относительно общего характера организации активного центра и прилегающих к нему участков оказались правильными. Более того, на основании этих данных сразу же удалось расположить молекулу ДНК-матрицы на белке и определить направление транскрипции - от иона магния в сторону кармана, где были локализованы мутации устойчивости к рифампицину (Zhang et al., 1999). Дополнительные эксперименты по химическим сшивкам позволили нам в содружестве с лабораторией С. Дар-ста построить пространственную модель комплекса РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотгми в процессе удлинения (элонгации) цепи РНК (Korzheva et al., 2000; Korzheva, Mustaev, 2001). При построении модели мы придерживались весьма жесткого ограничения, согласно которому ДНК-ДНК- и РНК-ДНК дуплексы имели жесткую структуру, известную для нуклеиновых кислот вне комплексов с белками, а изменений в структуре РНК-полимеразы не допускалось. Поэтому модель не претендует на детальное описание взаимодействий индивидуальных звеньев нуклеиновых кислот и аминокислотных остатков РНК-полимеразы.
Предложенная нами модель дает представление о том, где должны располагаться постулированные нами ранее замки, и ясно показывает, что для их закрывания необходимо сближение верхней и нижней челюстей РНК-по-чимеразы. В формировании переднего замка может участвовать стенка, а в формировании заднего замка - шип, как это показано на рисунке. Для заслонки напрашивается важная роль во взаимодействии РНК-полимеразы со шпильками РНК в процессе терминации и при паузах. В настоящее время мы занимаемся проверкой этих предсказаний.
Весной 2001 г. появились пространственные модели РНК-полимеразы II дрожжей высокого разрешения, построенные на основании рентгенострукт-руктурного анализа кристаллов свободной РНК-полимеразы (Cramer et al.,
2001) и РНК-полимеразы в элонгационном комплексе с ДНК и РНК-продук-том (Gnatt et al., 2001). Как и ожидалось, не только общая организация, но и большинство деталей структуры в районе активного центра и района, обеспечивающего удержание РНК-ДНК гибрида, у дрожжевой и бактериальных РНК полимераз очень похожи. Существенные отличия наблюдаются на пе-реферии, где располагаются малые субъединицы дрожжевой полимеразы, в частности в тех районах, которые обеспечивают удержание переднего и заднего ДНК-дуплекса. Анализ структур подтвердил наше предположение
118
о том, что в процессе формирования транскрипционного комплекса происходит сближение челюстей фермента, и позволил идентифицировать шарнирные участки, ответственные за этот структурный переход. Эти данные показали, что замыкание РНК-полимеразы вокруг ДНК происходит совсем по-другому, чем в случае репликации ДНК (Jeruzalmi et al., 2001).
ПЕРСПЕКТИВЫ
Наша долгосрочная цель при изучении элонгации заключается в выяснении динамики активного центра в этом процессе и расшифровке структурных механизмов передачи регуляторных сигналов от белковых факторов к активному центру. При выборе конкретных задач на ближайшее время мы уделили особое внимание тем деталям активного центра, в которых на фоне значительного структурного сходства бактериальной и дрожжевой РНК-по-лимераз, удалось обнаружить характерные отличия. В настоящее время мы пытаемся выяснить возможную функциональную роль этих различий.
