Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
При добавлении NTP к открытому промоторному комплексу РНК-поли-мераза синтезирует и тут же высвобождает набор коротких РНК длиной от 2 до 8 нуклеотидов, не теряя прочных контактов с ДНК-матрицей. Переход от этой стадии абортивного синтеза к стадии элонгации сопровождается существенными структурными перестройками комплекса, в результате которых прочность комплекса значительно возрастает (Mooney et al., 1998). Транскрипционный комплекс на стадии элонгации отличается поразительной стабильностью, позволяющей РНК-полимеразе, не покидая матрицы, синтезировать молекулы РНК длиной до 104 н. в случае бактерий и до 10б н. - в случае эукариот (Landick, 2001).
113
Катализ образования фосфодиэфирной связи между 3'-концом растущей цепи РНК, занимающим так называемый (1)-центр РНК-полимеразы, и 5'-концом альфа-фосфата входящего NTP, занимающего (i + 1)-центр, осуществляется ионом магния, располагающимся на РНК-полимеразе около (i)- и (i + 1)-центров (Zaychikov et al., 1996). После присоединения очередного нуклеотида, сопровождающегося освобождением пирофосфата, его 3'-конец некоторое время остается в претранслокационном состоянии, занимая (i + 1)-центр.
В определенных положениях матрицы РНК-полимераза может переходить в арестованное состояние, в котором она, сохраняя прочную связь с матрицей и РНК-продуктом, теряет способность удлинять цепь РНК. Выход из этого состояния возможен только через эндонуклеотическое расщепление цепи РНК (Surratt et al., 1991) на расстоянии нескольких (иногда более десяти) нуклеотидов от ее 3'-конца. Скорость этой реакции, осуществляемой самой РНК-полимеразой (Orlova et al., 1995), значительно стимулируется специальными факторами элонгации: GreA и GreB у бактерий (Borukhov et al.,
1992, 1993) и TFSII у эукариот (Reines et al., 1989). После отщепления фрагмента РНК РНК-полимераза выходит из арестованного состояния, приобретая способность присоединять нуклеотиды к новообразованному 3'-концу РНК. Мы обнаружили, что переход в арестованное состояние происходит в результате возвратного движения РНК-полимеразы (backtracking), при котором несколько 3'-концевых нуклеотидов вытесняются из гибрида с матричной нитью ДНК (Komissarova, Kashlev, 1997; Nudler et al., 1997). В результате активный центр РНК-полимеразы теряет связь с 3'-концом РНК, но приобретает способность расщеплять фосфодиэфирную связь, против которой он оказался.
В определенных положениях матрицы происходят замедления (паузы) в движении РНК-полимеразы, особенно заметные при низких концентрациях субстратов. Длительность пауз у бактерий модулируется регуляторными белками NusA и NusG. Паузы сопровождаются возвратными движениями РНК-полимеразы, которые, в отличие от возвратных движений при аресте, имеют меньшую амплитуду и носят обратимый характер. При обратимых возвратных движениях, так же как и при аресте, возможно расщепление РНК с последующим наращиванием новообразованного 3'-конца. Предполагается, что эти процессы не только регулируют скорость элонгации, но и позволяют осуществлять коррекцию РНК в случае включения некомплементарного нуклеотида.
Для терминации транскрипции необходима дестабилизация элонгацион-ного комплекса. В случае бактерий это происходит в результате взаимодействия РНК-полимеразы со специальными последовательностями РНК, закодированными в ДНК-терминаторами (Uptain et al., 1997; von Hippel, 1998; Nudler, 1999). Для узнавания некоторых терминаторов бактериальной РНК-полимеразе не требуется никаких белковых факторов. Важную роль в таких терминаторах играют шпильки РНК.
114
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ
МИНИМАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ THERMUS AQUATICUS МЕТОДАМИ РЕНТГЕНОВСКОЙ КРИСТАЛЛОГРАФИИ
Кристаллы минимальной РНК-полимеразы Т. aquaticus давали рентгеновские рефлексы, соответствующие умеренному разрешению 3,7 ангстрема. При таком разрешении нельзя увидеть положение боковых цепей без привлечения дополнительной информации. Подробное описание процедур, позволивших значительно улучшить модель и добиться разрешения индивидуальных аминокислотных остатков, можно найти в статьях (Zhang et al., 1999; Darst, 2001). Важную роль сыграли наши данные, позволившие определить положения иона магния, удерживаемого небольшим эволюционно консервативным (т.е. практически одинаковым у всех исследс ванных живых организмов) участком Р'-субъединицы (Zaychikov et al., 1996).
При описании структуры молекулы РНК-полимеразы (см. рис. 36) используется пестрая смесь терминов, заимствованных из анатомии и техники. Чаще всего встречается сравнение с клешнями краба. Одна из клешней (или челюстей), которая на исходном рисунке была помещена наверху и названа крышей, образована в основном (3-субъединицей, а другая - Р'-субъединицей. Между клешнями располагается канал, средняя ширина которого составляет 27 ангстрем. Наличие канала, в котором может поместиться двуни-тевая ДНК, было обнаружено ранее при изучении структур РНК-полимера-зы низкого разрешения (12-25 ангстрем). Совершенно неожиданно оказалось, что в этом канале имеется мостик, образованный центральной частью эволюционно консервативного района FP'-субъединицы, имеющий спиральную структуру. Этот так называемый P'-F-мостик пересекает канал примерно посередине, связывая верхнюю клешню с нижней. К P'-F-мостику прилегает петля, образованная консервативным районом GP'-субъединицы. Вместе они образуют стенку, которая разделяет канал на главный и малый каналы. Малый канал имеет диаметр около 12 ангстрем и следовательно слишком узок для того, чтобы пропускать двунитевую ДНК. Каталитический ион магния располагается при входе в малый канал.
