Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
111
возможность описать последовательные стадии транскрипции и выяснить важные принципы организации транскрипционных комплексов на каждой из этих стадий. Было выяснено, что важную роль в транскрипции и ее регуляции играет конформационная подвижность компонентов реакции. Лучше всего была изучена конформационная подвижность нуклеиновых кислот в этих комплексах (Korzheva et al., 1998). Менее подробно и главное менее конкретно была изучена конформационная подвижность самой РНК-поли-меразы (Gross et al., 1998). И лишь недавно ситуация резко изменилась. В 1999 г. рентгеноструктурными методами высокого разрешения была установлена пространственная структура РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus (Zhang et al., 1999), а в 2001 г. РНК-полимеразы II дрожжей (Cramer et al., 2001; Gnatt et al., 2001). Эти работы открыли совершенно новые возможности для структурно-функциональных исследований транскрипции путем проецирования результатов косвенных методов на уже установленные пространственные структуры высокого разрешения. Примером такого подхода является наша работа (Korzheva et al., 2000), в которой была построена первая реалистичная молекулярная модель транскрипционного комплекса путем проецирования на кристаллическую структуру минимальной РНК-полимеразы Т. aquaticus результатов картирования химических сшивок РНК-полимеразы Е. coli с искусственными конструкциями, имитирующими ДНК-матрицу и PHK-продукт. Мы надеемся, что использование такого подхода позволит зарегистрировать состояния транскрипционных комплексов, которые трудно или невозможно закристаллизовать, и значительно продвинуться в выяснении молекулярных деталей динамики активного центра РНК-полимеразы и механизмов передачи регуляторных сигналов от белков-регуляторов к этому центру. В данном обзоре кратко изложены основные результаты и перспективы исследований РНК-полимеразы Е. coli в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов. Более подробно механизм функционирования РНК-полимеразы и история ее исследований описаны в обзоре (Никифоров, 2002).
СУБЪЕДИНИЧНАЯ СТРУКТУРА РНК-ПОЛИМЕРАЗ
РНК-полимеразы эубактерий состоят из 6 субъединиц. (3-, (3’-, (0- и две идентичные а-субъединицы образуют кор, или минимальный фермент, обладающий каталитической активностью, но не способный узнавать начала генов и обеспечивать их специфическую транскрипцию (Zhang et al., 1999). Такой способностью обладает полный фермент (холофермент), содержащий всего одну дополнительную субъединицу a (Gross et al., 1998, Wosten et al., 1998). Из изученных бактерий только микоплазмы обходятся единственной а-субъединицей. Остальные бактерии содержат несколько разных а-субъединиц, одна из которых является главной. Есть бактерии с тремя разными субъединицами, у Е. coli их 7, у В. subtilis - 18; рекордсменом на данный момент является Streptomyces coelicolor, содержащая более сорока разных а-субъединиц (http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_coelicolor/). Присоединение разных а-субъединиц придает PHK-полимеразе способность использовать разные группы промоторов, что широко используется для регуляции транскрипции. Кроме того, регуляция работы бактериальных промоторов -
112
у Е. coli их не менее пятисот - осуществляется с помощью белков-репрессо-ров и белков-активаторов. В регуляции индивидуального промотора обычно участвует небольшое число (один-два) белков-регуляторов. Всего у Е. coli их насчитывают 240-260 (Ishihama, 2000) у Pseudomonas aeruginosa (5570 генов) было обнаружено 408 потенциальных регуляторов транскрипции (Stover et al., 2000). Один белок-регулятор может участвовать в регуляции нескольких разных промоторов.
Процесс транскрипции у эукариот протекает с участием гораздо большего числа белков, чем в случае бактерий. Транскрипцию хромосомной ДНК у эукариот обеспечивают три эволюционно родственные транскрип-тазы: РНК-полимеразы I, II и III, состоящие из 14, 12 и 17 полипептидов соответственно. 5 субъединиц являются общими для всех трех форм, две - для РНК-полимераз I и III (Bell, Jackson, 2000). Две самые большие субъединицы проявляют сходство по аминокислотной последовательности с соответствующими субъединицами ((3 и (3') бактериальных РНК-полимераз. Подобно минимальным РНК-полимеразам эубактерий, вышеописанные РНК-полимеразы не способны самостоятельно начинать транскрипцию с промоторов. Для базальной (не регулируемой промотор-специфичными белками-регуляторами) транскрипции требуется набор белковых факторов GTF (general transcription factors). Для РНК-полимеразы II (молекулярная масса 513 KDa) насчитывают не менее 25 GTF с общей массой 1500 Kda (Lee, Young, 2000). Для регулируемой инициации транскрипции РНК-поли-меразой II с индивидуальных промоторов кроме специфических белков активаторов и GTF необходим медиатор, содержащий двадцать субъединиц (Dotson et al., 2000; Myers, Komberg, 2000). Общая масса медиатора составляет 1000 KDa.
ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ЦИКЛ
РНК-полимеразы осуществляют последовательное наращивание цепи РНК, используя в качестве субстратов рибонуклеозидтрифосфаты (NTP) и одну из двух нитей ДНК в качестве матрицы. Синтез РНК начинается с присоединения молекул РНК-полимеразы к специальным участкам ДНК - промоторам, определяющим специфические места инициации транскрипции (DeHaseth et al., 1998). Присоединение РНК-полимеразы Е. coli, содержащей а70, к промотору завершается расплетанием 10-15 пар оснований двойной спирали ДНК с образованием так называемого открытого промоторного комплекса, способного к инициации синтеза РНК.
