Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Из других бросающихся в глаза структурных элементов главного канала следует отметить потенциально подвижную заслонку (flap), закрывающую главный канал на одном из его концов, и петлю, поддерживаемую спи-раль-спираль-подобной структурой, которая по терминологии Дарста напоминает руль самолета (rudder) и которую я предлагаю называть по-русски шипом.
Рассмотрение структуры показывает, что эволюционно консервативные участки р- и Р'-субъединиц пространственно сближены, образуя сердцевину минимальной РНК-полимеразы в виде сферы диаметром 80 ангстрем с центром в районе каталитического магния. Этот результат согласуется с нашими данными по расщеплению РНК-полимеразы свободными радикалами, испускаемыми ионами железа, введенными в РНК-полимеразу вместо каталитического иона магния (Mustaev et al., 1997).
115
КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В ЛАБОРАТОРИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ДОРЕНТГЕНОВСКУЮ ЭРУ
Начало исследованиям РНК-полимеразы в нашем Институте положила работа Хесина и сотрудников, продемонстрировавшая, что РНК полимераза Е. coli способна считывать с очищенной ДНК фага Т2 не все имеющиеся в ней гены, а только те, которые функционируют в живой клетке на ранних стадиях инфекции (Хесин и др., 1962). Эта классическая работа продолжает цитироваться и обсуждаться и в настоящее время (Kolesky et al., 1999).
Крупным прорывом было получение первых мутаций, изменяющих гены РНК-полимеразы Е. coli, а следовательно, и свойства самого белка. Это были мутации устойчивости к антибиотикам рифампицину и стрептолидиги-ну (Ovchinnikov et al., 1983; Лисицын и др., 1985 ) и первая условнолетальная мутация tsX (Khesin et al., 1969). Молекулярная природа дефекта, вызываемого мутацией tsX, была вскрыта много позже (Nedea et al., 1999).
После того как в лабораториях Овчинникова и Свердлова была определена полная первичная структура генов РНК-полимеразы Е. coli (Ovchinnikov et al., 1977, 1981, 1982), в совместной работе лабораториий Хесина и Свердлова были расшифрованы первые мутации устойчивости к антибиотику рифампицину. На Западе эти работы были продолжены в конце десятилетия (Jin, Gross 1988). Время от времени возвращаемся к ним и мы. В последние годы, когда устойчивость к рифампицину возбудителя туберкулеза стала грозной международной проблемой, эти работы продолжают цитироваться (Ramaswamy, Musser, 1998).
Новый этап исследований начался после того как в лаборатории Гольд-фарба в Нью-Йорке была разработана система сверхпродукции всех субъединиц РНК-полимеразы Е. coli и сборки из них активного фермента (Zalenskaya et al., 1990), а в ЛМГМ была разработана система генетического анализа сверхпродуцируемой Р-субъединицы и подготовлена программа направленного мутагенеза (Кашлев и др., 1989). В результате объединения усилий двух лабораторий появилась работа, в которой впервые была сконструирована летальная мутация, направленно изменяющая РНК-полимера-зу (Kashlev et al., 1990).
В ходе дальнейших исследований генетическими и биохимическими методами в наших лабораториях была изучена доменная организация Р- и Р'-субъединиц РНК-полимеразы Е. coli (Borukhov et al., 1991; Severinov et al.,
1992, 1995a, 1996). С помощью сочетания генетических и химических методов в составе доменов локализованы участки, имеющие отношение к связыванию субстратов (Mustaev et al., 1991; Lee et al., 1991; Sagitov et al., 1993; Zakharova et al., 1998; Polyakov et al., 1999), подробно изучены участки связывания антибиотиков рифампицина и стрептолидигина (Лисицин и др., 1985; Огрызько и др., 1988; Mustaev et al., 1991,1994; Lee et al., 1991; Severinov et al.,
1993, 1994a, 1995), обнаружены участки, имеющие отношение к взаимодействию РНК-полимеразы с ДНК (Martin, 1992; Nudler et al., 1996) и факторами Ale фага Т4 (Severinov et al., 1994) и gp2 фага T7 (Nechaev, Severinov, 1999). Локализованы участки РНК-полимеразы, окружающие ион магния, участвующий в катализе (Zaichikov et al., 1996; Mustaev et al., 1997). В результате этих исследований мы пришли к заключению, что эволюционно консерва-
116
тивные участки РНК-полимеразы формируют каталитический центр, а эво-люционно вариабельные участки отвечают за взаимодействие с регуляторными белками. Это заключение полностью подтвердилось при анализе рентгеновских структур.
Особое внимание в наших исследованиях последнего десятилетия уделялось стадии элонгации РНК. Долгое время считалось, что эта стадия не представляет особого интереса с точки зрения регуляции генной активности и является относительно простым монотонным процессом, в котором присоединение очередного нуклеотидного звена к цепи РНК ничем не отличается от присоединения всех предыдущих и последующих звеньев. Интерес к стадии элонгации резко возрос после обнаружения неравномерности движения РНК-полимеразы и открытия белковых факторов, модулирующих скорость этого движения. Важным событием стала работа М. Чемберлена с соавторами (Surratt et al., 1991) которые обнаружили, что в процессе элонгации РНК-полимераза может осуществлять реакцию расщепления РНК-продук-та. Нами были открыты элонгационные факторы GreA и GreB, стимулирующие этот процесс (Borukhov et al., 1992, 1993). Изучена доменная организация этих факторов (Koulich, 1998). Были разработаны методы исследования структуры транскрипционного комплекса, иммобилизованного на твердом носителе (Kashlev et al., 1993). С их помощью показано, что на определенных участках матрицы РНК-полимераза переходит в нестабильное состояние, для которого характерны нарушение нормальных контактов с ДНК, резко повышенная чувствительность к фактору GreB и склонность к переходу в неактивное, так называемое арестованное состояние (Nudler et al., 1995; Komissarova, Kashlev, 1997). Получены данные, свидетельствующие о том, что переход в такое нестабильное состояние играет ключевую роль на стадии терминации транскрипции. Установлено, что переход в нестабильное состояние обусловлен сдвигом РНК-полимеразы назад (backtracking), а не ее сжатием, как одно время представлялось в рамках модели червеобразного движения РНК-полимеразы (Komissarova, Kashlev, 1997; Nudler et al., 1997).
