Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
Многообещающим подходом к изучению функций отдельных частей молекулы бактериородопсина может быть направленный мутагенез. С этой целью Корана и соавт. [512, 951, 1008] выделили и клонировали ген бактериородопсина. Затем в нем были сделаны замены в единичных кодонах и осуществлен биосинтез модифированных бактериородопсинов [666]. Выяснилось, что замена Lys-216 на Ala или Val предотвращает образование окрашенного продукта из бактериородопсина и ретиналя. Такой же эффект имели следующие одиночные замены: Asp-212 —Asn, Ala-215 —Lys, Val-213 —Lys и Tyr-185 —Phe. He приходится удивляться, что замена Lys-216, к которому крепится ретиналь, делает невозможным образование пигмента. Что касается трех замен вблизи Lys-216, то они, по-видимому, как-то влияют на ближайшее окружение Шиффова основания. В частности, предполагается, что карбоксил Asp-212 образует солевую связь с протони-рованным азотом Шиффова основания (см. выше уравнение 23а).
Неясно, какова роль ОН-группы Туг-185, локализованного в колонне F. Было высказано предположение, что эта группа находится вблизи С13-метила ретиналя, существенного для работы бактериородопсина (см. ниже).
1 Возникает вопрос, несут ли вообще какую-либо функциональную нагрузку выставленные в воду терминальные последовательности бактериородопсина. В этой связи можно высказать следующее соображение. Мембрана существует только тогда, когда она состоит из компонентов, образующих гидрофобную сердцевину и гидрофильные поверхности раздела фаз. В фосфолипидах эти две функции выполняют соответственно углеводородные цепи жирных кислот и заряженные головки, содержащие фосфатный остаток. В пурпурных бляшках количество фосфолипидов слишком мало, чтобы образовать непрерывный бислой. Очевидно, что гидрофобная сердцевина бляшки образована а-спиральными колоннами бактериородопсина. Что касается гидрофильной части, то она может быть организована за счет аминокислотных последовательностей, экспонированных в воду. Пять из 17 аминокислотных остатков на С-конце бактериородопсина заряжены отрицательно, поскольку они содержат свободные карбоксильные группы, которые несомненно должны вносить свой вклад в создание поверхностного заряда на цитоплазматической стороне бляшки. Показательно, что удаление обращенных в воду участков бактериородопсина при обработке протеиназой резко повышает тенденцию бляшек к агрегации [1148].
172
3. Первичные А(хН-генераторы
Было также показано [666], что замена Тгр-189 на Phe вызывает изменение спектра поглощения бактериородопсина. Следующие замены никак не влияют на его спектральные характеристики: Ser-193 —Ala, Glu-194 —Gin, Ile-203 Leu. К сожалению, способность этих аналогов бактериородопсина переносить протоны осталась неисследованной.
Есть указания, что Туг-26 и Туг-64 необходимы для транспорта Н+. Их химическая модификация тормозит активность бактериородопсина (см. обзор: [459]). Ротшильд и соавт. [1271] измерили инфракрасные дифференциальные спектры бактериородопсина с изотопно меченными тирозинами. Полученные данные указывают на протонирование ионизованной группы тирозина (тирозината) при переходе bR К (см., однако, [535]). Ю. А. Овчинниковым и соавт. [100] показано, что один из остатков тирозина участвует в образовании интермедиата М.
Рассматривая возможные варианты укладки полипептидной цепи бактериородопсина, не удается избежать ситуации, когда несколько заряженных аминокислотных остатков оказывается в гидрофобной части мембраны. В то же время в комплексе реакционных центров Rps. viridis все такие остатки располагаются на поверхностях раздела мембрана/вода (см. раздел 3.1.2).
Объяснение этого различия двух Д[ГН~генераторов может состоять в том, что комплекс реакционных центров переяосит через мембрану электрон, а бактериородопсин — протон. Двигаясь поперек мембраны по комплексу реакционных це-нтров, электрон перескакивает с одной простетической группы на другую. В бактериородопсине такого рода эстафетный механизм должен переносить протон. В этом процессе могли бы участвовать заряженные аминокислотные остатки.
Наблюдения, сделанные в лабораторях Хесса и Зиберта [533], свидетельствуют об участии нескольких (предположительно четырех) карбоксильных групп в переносе протонов бактериородопсином. В этой работе авторы также использовали дифференциальную спектроскопию в инфракрасной области. В качестве объекта исследования служил бактериородопсин с [4-С13]-аспар-татами. Сопоставив кинетику протонирования—депротонирования аспартатных карбоксилов со скоростями взаимопревращения интермедиатов фотоцикла, Энгельгард и Хесс [534] предложили cxei^y протонпроводящих путей в молекуле бактериородопсина, показанную на рис. 64, б. Судя по нашим данным [500], пере-ХОд м —Р обусловлен внутримолекулярным переносом Н+ от какой-то протолитической группы бактериородопсина (на рис. 64, б это ХН) к Шиффову основанию, а переход Р -> bR есть следствие протонирования X цитоплазматическими ионами Н+.
Независимые исследования в нескольких группах продемонстрировали, что для своей активности бактериородопсин требует ион металла. Природа металла оказалась не существенной на
