Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
СН3
СН3
О
(23а)
:NH
\
3.5. Бактериородопсин
№
Периплазма
Периплазма
t
AspI '-СОО© AspI - СООН
©
—С—NH— AspII - COO ®
AspIII - COO ° Y-COO© Me2*
Цитоплазма
6
a
Рис. 64. Бактериородопсин как Д(хН-гене-ратор
а — схема протонпроводящих путей; 1 — светозависимая изомеризация ретиналя из полностью транс- в 13-цис-форму, ведущая к перемещению протонированного азота Шиффова основания от конца входного протонпроводящего пути к началу выходного протонпроводящего пути; г — Н+ отщепляется от азота Шиффова основания и по выходному пути переносится к внешней поверхности мембраны. Затем происходит обратная (13-цис -?+ полностью транс) изомеризация ретиналя, и депротонированное Шиффово3 основание возвращается в исходное положение, т. е. к концу входного канала (на схеме не показано); з — протонирование Шиффова основания ионом Н+, перенесенным из цитоплазмы по входному пути;
— прздцолагаемыз компоненты протонпроводящих путей в молекуле бактериоро допсина; ХН и Y—СОО~ — неизвестные протондонорные и протонакцепторные группы (вероятно, остатки тирозина и аспартата); Me2* — ион металла, необходимый для работы бактериородопсина (по: Энгельгард и Хесс [534])
Чтобы объяснить как-то иначе наблюдаемое соотношение электро-генных стадий, необходимо дополнительное предположение, что проводимость выходного пути много больше таковой входного.
Механизм, показанный на рис. 64,— простейший из возможных. Его придется усложнить, если выяснится, что бактериородопсин переносит не один, а два протона на каждый поглощенный квант света. Некоторые указания в этом направлении можно найти в литературе [1141, 1247, 1457]. Однако, как показало специальное исследование, проведенное в нашей группе, такого рода «суперстехиометрия» оказалась результатом ошибки в расчетах [498].
Предложенная схема позволяет понять механизм ингибирования бактериородопсина кислым pH и ионами La3+. Показано*.
170
3. Первичные Л^Н-генераторы
в частности, что как микро-, так и миллисекундные электроген-ные стадии блокируются при подкислении среды ниже pH 3,5 [494]. Именно такой эффект можно ожидать, когда Шиффово основание (или какая-либо функциональная группа выходного пути) теряет способность отдавать протон. В то же время La3+ оказался специфическим ингибитором миллисекундной стадии, как если бы он блокировал входной путь. Таким же эффектом обладал Са24\ но при больших концентрациях [484, 493, 494]. Мы предположили, что действие La3+ и Са2+ обусловлено связыванием этих катионов какими-то анионными группами на цитоплазматической поверхности мембраны, существенными для нативной конформации белка, необходимой при репротонировании Шиффова основания. Эта гипотеза была недавно подтверждена Синьоре и Риго [1347], показавшими, что La3+ тормозит работу бактериородопсина только в «вывернутых» протеолипосомах.
Остается неясным механизм переноса протона по Непроводящим путям внутри мембраны. Это может быть эстафетная передача протона от одной протонакцепторной группы белка к другой или сдвиг протонов вдоль цепочки водородных связей, принадлежащих белку либо молекулам воды, сорбированным на белке и фосфо(сульфо)липидах пурпурной бляшки.
Было предпринято несколько попыток идентифицировать функциональные группы, участвующие в протонпроводящих путях. С этой целью использовались два подхода: 1) специфическая модификация либо удаление определенных аминокислотных остатков или их замена остатками других аминокислот и 2) измерение состояния функциональных групп аминокислот в интактном белке.
Сведения, полученные с использованием первого подхода, могут быть интерпретированы однозначно, если модификация, удаление или замена аминокислоты не влияют на транспорт Н+. В таком случае можно с уверенностью сказать, что данный аминокислотный остаток не существен для функционирования системы транспорта протонов. Если же измененный бактериородопсин утрачивает способность перекачивать протоны, то мы оказываемся перед дилеммой: либо исследуемый остаток прямо участвует в транспорте Н+, либо он необходим для поддержания нативной структуры транспортной системы.
Как показали опыты, проведенные нами совместно с Ю. А. Овчинниковым и его коллегами [148, 1148], удаление трех аминокислот с N-конца, 17 аминокислот с С-конца, а также пяти аминокислот (от Met-68 до Gly-72) из гидрофильной связки между а-спиралями В и С не влияет на транспорт протонов и кинетику отдельных электрогенных стадий. Впоследствии это наблюдение было подтверждено Кораной и соавт. [934]. Авторы не только расщепили бактериородопсин на два фрагмента (А—В и С—G), но и препаративно разделили эти фрагменты, а затем реконструировал и в протеолипосомах. Полученная система была способна
3.5. Бактериородопсин
171
к светозависимому переносу ионов водорода. Эти опыты показывают, что структура бактериородопсина столь сильно стабилизирована нековалентными взаимодействиями, что расщепления некоторых пептидных связей оказывается недостаточным, чтобы нарушить структуру протонного насоса. В поддержание этой структуры, по-видимому, вносит определенный вклад остаток ретиналя. Так, было найдено, что добавка ретиналя стабилизирует нативную конформацию бактериородопсина, реконструированного из А—В- и С—G-фрагментов полипептидной цепи [934] х.
