Энергетика биологических мембран - Скулачев В.П.
ISBN 5-02-004027-4
Скачать (прямая ссылка):
Как видно из графика, кинетика образования и распада М412 совпадает соответственно с выделением и поглощением Н+ блинками. Поскольку процессы образования М412 и выделения Н+ оказались намного быстрее (ty2 около 250 мкс), чем распад М412 и поглощение Н+ (ty2 порядка 30 мс), то их можно было легко соотнести с двумя основными электрогенными процессами, наблюдавшимися в системе бляшки—коллодиевая пленка (приведенные выше величины fi/2 относятся к температуре, равной 5°, при которой ставили этот опыт). Ясно, что образование М412 и выброс Н+ коррелируют с электрогенной фазой, развивающейся в микросекундной временной шкале. Соответственно распад M4j2 и поглощение Н+ коррелируют со второй (миллисекундной) электрогенной фазой. Заметим, что соотношение амплитуд микро-
3.5. Бактериородопсин
167
и миллисекундных фаз генерации Д? оказывается порядка 1 : 4 [58, 498].
Измерение ДЧ1- с большим временным разрешением позволило нам обнаружить еще одну электрогенную стадию (U/2 < 50 не) [497]. Ее скорость была недавно измерена венгерскими биоэнергетиками. Она оказалась 30 ± 10 пс [651]. Стадия, о которой идет речь, очень мала по амплитуде. Она характеризуется направлением электрического вектора, противоположным таковому более медленных электрогенных стадий (см. ниже рис. 68).
Опыты на суббактериальных пузырьках показали, что освещение вызывает быстрое выделение ионов Н+. Затем следует очень медленное поглощение выделенных Н+-ионов. Поглощение резко ускоряется протонофорами, как если бы ионы Н+ черпались из водной фазы внутри пузырька. В то же время протеолипосомы, имеющие обратную ориентацию мембраны, в ответ на свет демонстрируют быстрое поглощение Н+, после чего происходит медленное выделение этих ионов [633].
Описанные выше соотношения указывают, что трансмембранный перенос ионов Н+ бактериородопсином должен быть направлен из цитоплазмы в периплазму бактериальной клетки. В полном соответствии с этим выводом оказались результаты опытов на клетках, суббактериальных пузырьках, протеолипосомах и бляшках, сорбированных на коллодиевой пленке. Было найдено, что микро- и миллисекундные электрогенные стадии имеют такое направление, как если бы положительные заряды переносились от цитоплазматической к периплазматической поверхности. Предшествующая им быстрая электрогенная фаза может объясняться небольшим сдвигом положительного заряда в противоположную сторону.
Еще один эффект важен для понимания рассматриваемого механизма. Это сдвиг рК Шиффова основания. В исходном состоянии бактериородопсина рК выше 11. Поглощение кванта света сдвигает рК к 3,5, что совпадает с переходом bR в М412. Сказанное означает, что Шиффово основание, протонированное в темноте, под действием света должно терять протон, если pH среды выше 3,5.
3.5.6.2. Возможный механизм перекачки протонов
Приняв во внимание факты, перечисленные в предыдущем разделе. мы можем описать механизм работы бактериородопсина как процесс, состоящий из четырех основных стадий.
Стадия 1. Поглощение фотона остатком полностью транс-ретиналя вызывает его изомеризацию в 13-г^с-ретиналь. Если полиеновая цепь ретиналя прочно фиксирована в молекуле белка, а Шиффово основание имеет возможность переместиться, то изомеризация должна выззать такое перемещение. По-видимому,
168
3. Первичные AiiH-генераторы
изомеризация ретиналя имеет следствием перемещение Шиффова основания из окружения, благоприятного для его протонирования, в окружение, благоприятное для депротонирования. Такой эффект может возникать при удалении атома азота Шиффова основания от какой-нибудь отрицательно заряженной группы, например, ионизованного карбоксила остатка аспартата, который, как думают, образует в bRS6S солевую связь с Шиффовым основанием:
Движение протонированного Шиффова основания может быть измерено как электрогенный процесс (смещение заряда), если оно происходит не параллельно плоскости мембраны, а перпендикулярно или под углом к ней. Может быть, именно этот эффект обусловливает возникновение самой быстрой (обратной) электрогенной стадии в фотоэлектрическом ответе бактериородопсина.
Стадия 2. Шиффово основание, очутившись в новом месте, освобождает протон. Последний затем транспортируется к пери-плазматической поверхности мембраны по выходному Непроводящему пути, который связывает эту поверхность с местом внутри молекулы белка, где локализовано Шиффово основание остатка 13-г^с-ретиналя. Перенос Н+ по выходному пути дает микросе-кундную стадию фотоэлектрического ответа.
Стадия 3. Депротонированный остаток 13-г^с-ретиналя переносится в исходное положение, протонируется какой-то протоли-тической группой белка и изомеризуется в полностью транс-изомер.
Стадия 4. Протолитическая группа репротонируется ионом Н+, перенесенным по входному Н+-пути. Этот путь соединяет цитоплазматическую поверхность мембраны с местом, где находится Шиффово основание. Перенос Н+ по входному пути обусловливает появление последней (миллисекундной) электрогенной стадии.
Приняв, что величины диэлектрических постоянных в областях выходного и входного путей сходны, можно заключить, что первый примерно вчетверо короче второго, поскольку соотношение амплитуд микро- и миллисекундных электрогенных стадий равно четырем. Поэтому Шиффово основание должно быть локализовано гораздо ближе к внешней поверхности мембраны, чем к внутренней (рис. 64). Этот вывод находится в хорошем соответствии с данными, полученными другими методами (см. раздел 3.5.2).
