Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Используя систему самокоррекции, ДНК-полимераза ведет синтез с исключительно высокой быстротой и точностью. В среднем одна ошибка приходится на 10° нуклеотидов. Геном Е. coli имеет размер 4,2 х 10h нуклеотидов. Это значит, что при репликации 200 геномов допускается всего одна ошибка.
Присутствие у фермента корректирующей способности означает, что для инициации репликации на матрице ему необходим хотя бы короткий участок двуцепочечной ДНК, с которого начинается синтез комплементарной цепи. Такой участок называется праймером, или затравкой. Можно говорить, что всякий самокорректирующий фермент для начала работы нуждается в затравке. Справедливо и обратное утверждение: всякий фермент, требующий для работы затравки, обладает способностью к самокоррекции.
Структура репликативной вилки. Репликативная вилка асимметрична. Для синтеза лидирующей цепи, который идет непрерывно, затравка нужна только в начале полимеразной ре-
акции. Полимераза, ведущая синтез запаздывающей цепи, нуждается в затравке перед синтезом каждого фермента. Существует специальный фермент, создающий затравки. Он называется РНК-праймаза и синтезирует из рибонуклеозидтрифосфа-тов короткие РНК-праймеры длиной около 10 нуклеотидов. Из вышесказанного ясно, что этот фермент не нуждается в затравке, а значит, он не способен к самокоррекции. Такой фермент делает ошибки примерно в 1000 раз чаще, чем самокорректирующий. Ясно, что после синтеза фрагментов Оказаки праймер нужно удалять. В противном случае до 10% (у эукариот длина фрагментов Оказаки 100—200 н. п.) ДНК будет содержать огромное, по сравнению с нормой, число ошибок.
Для удаления праймеров и застраивания образовавшихся брешей в действие вступает особая система репарации ДНК. Основную роль здесь играет ДНК-полимераза I Е. coli и аналогичные ферменты других организмов. У эукариот это, по-ви-димому, ДНК-полимераза (3. ДНК-полимераза 1 — это первый из открытых ферментов, катализирующих полимеризацию нуклеотидов. Сначала его считали основным ферментом репликации, а позднее установили его репарирующую роль. ДНК-поли-меразу 1 можно представить как два фермента на одной поли-пептидной цепи. Первый называется фрагментом Кленова и обладает полимеразной и корректирующей (3’-»5’-экзонуклеаз-ной) активностями. Другой фрагмент способен отщеплять нуклеотиды в направлении 5’->3’, т. е. в направлении синтеза ДНК. Эта 5’-»3’-экзонуклеазная активность и дает возможность удалять затравку.
Синтез ДНК на запаздывающей цепи состоит, таким образом, из следующих этапов.
1. РНК-праймаза синтезирует затравки на некотором (равном длине фрагментов Оказаки) расстоянии друг от друга;
2. ДНК-полимераза 111 синтезирует фрагменты ДНК, начиная с З’-конца затравки и заканчивая на 5’-конце предыдущей затравки,
3. ДНК-полимераза I продолжает синтез фрагментов ДНК в направлении 5’->3\ одновременно удаляя затравку в том же направление;
4. Фрагменты ДНК «сшиваются», т. е. образуется фосфоди-эфирная связь между началом предыдущего и концом последующего фрагментов.
Целесообразен ли такой сложный механизм синтеза запаздывающей цепи? На этот вопрос можно ответить положительно, если принять во внимание то обстоятельство, что при синте-106
зе в направлении голова—хвост энергию для присоединения следующего нуклеотида несет уже присоединившийся нуклеотид. Если произойдет коррекция, этот нуклеотид будет удален и присоединение следующего станет невозможным. Таким образом, синтез в направлении 3’->5’ вести нецелесообразно, и плата за это — усложнение механизма синтеза одной из цепей
днк.
Понятно также, почему затравки состоят не из дезоксирибо-нуклеотидов. Они подлежат удалению, поскольку содержат много ошибок, и «метятся» необычными для ДНК рибонуклео-тидами, которые распознаются ДНК-полимеразой как «чужие».
Топоизомеразы. Две цепи ДНК, согласно модели Уотсона — Крика, образуют двойную спираль. Для того чтобы каждая из цепей стала матрицей для синтеза новой цепи, необходимо, чтобы нити ДНК расплелись. Эту функцию в процессе репликации выполняют специальные белки, называемые ДНК-геликазами. Молекула геликазы движется перед ДНК-полимеразным комплексом и раскручивает спираль ДНК в репликативной вилке, используя энергию гидролиза АТФ.
При расплетении спирали ДНК в нерасплетенной части должно возникнуть напряжение, которое приведет к положительной суперспирализации и вращению молекул ДНК- Это обстоятельство было высказано, как аргумент против полуконсер-вативного механизма репликации. В действительности ни вращения, ни положительной суперспирализации не происходит. Топологические проблемы «решает» группа ферментов, способных изменять степень спирализации ДНК- Они называются то-поизомеразами.
Топоизомеразы типа I могут снимать избыточную спирали-зацию. Они вносят временный разрыв в одну из цепей ДНК в области перед репликативной вилкой и дают, таким образом, спирали ДНК вращаться вокруг своей оси, снимая при этом избыточное напряжение и восстанавливая затем разорванную цепь.
Другой фермент, топоизомераза типа П, связывается на время с обеими цепями двойной спирали и вносят в нее временный двуцепочечный разрыв, удерживая при этом разорванные концы. Благодаря этому ферменту можно распутать сложные переплетения и узлы, которые возникают между дочерними молекулами ДНК после их синтеза. Кроме того, такая топоизомераза совершенно необходима при репликации кольцевых молекул ДНК для разъединения двух дочерних кольцевых молекул.
