Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Полиморфизм ДНК. Двуспиральную модель молекулы ДНК, предложенную Уотсоном и Криком, считают одним из несомненных фактов молекулярной биологии. Но в последнее десятилетие стало очевидным, что некоторые параметры классической В-формы нужно пересмотреть и даже что ДНК может образовывать другие типы двуспиральных структур. Таким образом, под полиморфизмом ДНК подразумевают способность двойной спирали принимать различные конформации.
Рис. 2.2. Комплементарное взаимодействие азотистых оснований (а). Расстояние между СГ-атомами дезоксирибозы в двух цепях одинаковы для АТ- и CG-лар и равны 1,085 нм. Схематическое изображение двойной спирали ДНК (б)
2.3. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК
К одному из основных свойств генетического материала относится его способность передаваться из поколения в поколение. Для этого каждая клетка должна дублицировать (удваивать) свою ДНК перед очередным делением. В результате дочерние клетки получают такую же генетическую информацию, как и у родительских клеток. Процесс самовоспроизведения генетического материала и называется репликацией. Репликация лежит в основе размножения и развития живых организмов.
Репликация ДНК полуконсервативна. Механизм репликации был предложен Дж. Уотсоном и Ф. Криком — авторами теории двойной спирали ДНК. Он предполагает расплетение двух цепей ДНК с тем, чтобы каждая из них могла служить матрицей для сборки второй цепи в соответствии с принципом комплементарно-сти. Таким образом, на матричной, или родительской, цепи одиночные нуклеотиды выстраиваются в определенном порядке и их последующая полимеризация приводит к образованию новой, или дочерней, цепи, комплементарной первой (рис. 2.3).
Несколькими годами позднее был открыт фермент, осуществляющий процесс полимеризации нуклеотидов. Его назвали ДНК-полимеразой. В качестве субстратов он использует дезок-сирибонуклеозидтрифосфаты и катализирует их полимеризацию на матрице (одноцепочечной ДНК). Источником энергии служит гидролиз пирофосфата.
Предложенный механизм репликации был назван полукон-сервативным, поскольку каждая из идентичных друг Другу дочерних молекул состоит из одной старой и одной новой цепи ДНК. Первые доказательства полуконсервативной репликации были получены в экспериментах М. Мезельсона и Ф. Сталя. Они использовали метод равновесного ценрифугирования в градиенте плотности. Суть его состоит в следующем. Концентрированные растворы солей тяжелых металлов, например хлорид цезия, по своей плотности могут соответствовать плотности ДНК. Если ДНК в таком растворе подвергнуть длительному центрифугированию, то в пробирке сформируется градиент концентрации, а значит, и градиент плотности соли. ДНК при этом займет в пробирке вполне определенное положение, соответствующее своей плотности. В том случае, когда ДНК представлена смесью молекул разной плотности, центрифугирование приведет к разделению препарата на несколько фракций.
В экспериментах было использовано то обстоятельство, что ДНК, содержащая азот l4N, отличается по плотности от ДНК, содержащей изотоп |0N, и соответствующие молекулы разделя-100
Рис. 2.3. Репликация ДНК по полукоисервативному механизму
ются при центрифугировании в градиенте плотности. Клетки_?. coli в течение многих поколений культивировали на среде с lnN. В результате практически вся бактериальная ДНК содержала в своем составе lnN. Затем клетки переносили на среду с l4N и периодически брали пробы для определения плотности ДНК (рис. 2.4). Оказалось, что после первого деления, на среде с l4N плотность ДНК была промежуточной между (1эЫ)ДНК и (l4N) ДНК, а после второго деления ДНК разделилась на две фракции: одна с промежуточной плотностью, как после первого деления, а другая—с плотностью (14N) ДНК, причем фракции были равными. После третьего деления ДНК имела плотность (I4N) ДНК и ‘/4 — плотность (14N — °N) ДНК. Соотношение и плотность фракций ДНК после каждого деления были в точности такими, как предсказывает модель полуконсерватив-ной репликации.
Модель также предсказывает, что в ДНК с промежуточной плотностью одна цепь тяжелая, а другая — легкая. С целью подтвердить это предположение фракция с промежуточной плотностью была выделена и денатурирована нагреванием. По-
1 Тяжелая I ДНК
Родительская ДНК (обе цепи тяжелые)
ДНК с двумя легкими цепями
Смесь \ тяжелой /и легкой ДНК
| Смесь тяжелой и легкой ДНК
ДНК \ из клеток
I первого поколения
Одна редупликация
Днк \ из клеток / второго поколения
Две редупликации
I
ДНК к из кпеток I третьего покопения
> Три редупликации
Рис. 2.4. Схема эксперимента М. Месельсона и Ф. Сталя, доказывающего их консервативный механизм репликации
следующее центрифугирование показало, что эта ДНК действительно состоит из цепей с различной плотностью.
Опыты, таким образом, полностью подтвердили правильность модели полуконсервативной репликации и стали первым весомым аргументом в пользу двойной спирали Уотсона — Крика.
