Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
исчезает, не добавляется и не превращается в другой нуклеотид, т. е. гомологичная рекомбинация внутри гена не приведет к потере его активности за счет мутации или сдвига рамки считывания.
Гомологичная рекомбинация происходит через образование промежуточного соединения, называемого структурой Холидея, или полухиазмой. Этот этап включает обмен цепями ДНК с их перекрещиванием (рис. 2.8). Сначала происходит разрыв в одной из цепей ДНК. В районе разрыва ДНК деспирализуется, и образуется одноцепочечный участок со свободным концом. Эта одноцепочечная ДНК «находит» комплементарную область в гомологичной молекуле ДНК и образует с ней двойную спираль, вытесняя при этом одноцепочечный участок гомологичной молекулы. Последний, в свою очередь, взаимодействует со свободным комплементарным участком гомологичной молекулы, в котором произошел инициирующий разрыв. Таким образом, две молекулы ДНК обмениваются одноцепочечными комплементарными участками с образованием гетеродуплексной ДНК.
Образовавшаяся структура обладает двумя важными свойствами. Точка обмена между двумя гомологичными цепями (точка скрещивания) может перемещаться вдоль гомологичных молекул, увеличивая или уменьшая гетеродуплексный участок. Такой процесс называется миграцией ветвей. Второе свойство заключается в том, что полухиазма может существовать в различных изомерных формах, возникающих при вращении составляющих элементов друг относительно друга. В результате две ранее перекрещивающиеся цепи становятся неперекрещиваю-щимися и наоборот.
Для разделения гетеродуплекса в каждой из перекрещивающихся цепей должен произойти разрыв. В зависимости от того, в каком из изомерных состояний находилась полухиазма во время разрыва, могут возникнуть два типа обменов. В одном случае окажется, что рекомбинирующие молекулы обменялись сравнительно короткими одноцепочечными участками, образовавшими гетеродуплексные районы. При другом способе рекомбинации часть каждой исходной спирали ДНК окажется присоединенной (ступенчатым соединением) к части другой спирали. Такой обмен называют собственно рекомбинацией.
Если рекомбинация пошла по первому пути, т. е. привела к образованию гетеродуплексных районов, то судьба последних может быть двоякой. Если неспаренные основания гетеродуплекса не репарируются, то после репликации в образовавшихся молекулах ДНК возникнут двуцепочечные участки из гомологичной молекулы ДНК, вступившей в обмен. В случае рекомби-116
Рис. 2.8. Схема кроссинговера по Холидею с учетом миграции и изомеризации Полухиазмы
нации в мейозе это приведет к постмейотической сегрегации (см. ниже). Если же репарация неспаренных оснований произойдет, то генетическая информация в обеих цепях бывшего гетеродуплекса станет идентичной, и один из возможных продуктов рекомбинации исчезнет и превратится в другой. Такой вариант рекомбинации называют генной конверсией.
Ферменты, осуществляющие общую рекомбинацию. У кишечной палочки общая рекомбинация зависит от белков — продуктов генов гес. Ключевую роль в обмене комплементарными цепями между рекомбинирующими молекулами и в образовании структуры Холидея играет гесА белок—продукт гена гесА. (Этот же белок активно участвует в процессе репарации.) Белок гесА стимулирует спаривание оснований между отдельной цепью ДНК и комплементарной ей цепью в двуспиральной молекуле ДНК. В результате образуется так называемая D-петля. Реакция получила название поглощение, или ассимиляция, цепи. Ассимиляция требует гидролиза АТФ и при наличии одного мономера АТФ на каждые 5—10 нуклеотидов одноцепочечной ДНК идет в оптимальном режиме.
Белок гесА покрывает одноцепочечную ДНК, и такой комплекс связывается с двуцепочечной ДНК. Однонитиевая ДНК перемещается вдоль гетеродуплекса, пока не будет найден участок гомологии. Затем происходит замена одной цепи на другую, причем перенос начинается с З’-конца ассимилирующей молекулы и идет в направлении 3’-»5’. Иначе говоря, с участием белка гесА белок способен обменивать цепи между двумя гомологичными двуцепочечными молекулами ДНК, осуществляя миграцию структуры Холидея.
Для действия гесА белка необходим свободный конец одноцепочечной ДНК. Образование одноцепочечных концов у Е. coli наиболее эффективно происходит с участием продуктов генов гесВ и гесС, которые представляют две из трех субъединиц одного фермента — экзонуклеазы V, или нуклеазы recBCD. Эта нуклеаза активируется при наличии двуцепочечных концов ДНК, которые могут возникать при облучении, при случайном разрыве матричной цепи в репликативной вилке или при переносе ДНК из клетки в клетку при конъюгации. Нуклеаза recBCD, присоединившись к двуцепочечному концу, движется вдоль молекулы ДНК и, подобно геликазам, расплетает двойную спираль, используя при этом энергию гидролиза АТФ.
Расплетенная ДНК после прохождения фермента может ре-натурировать, но скорость ренатурации меньше скорости расплетения. Таким образом, по мере продвижения нуклеазы recBCD на ДНК образуются растущие однонитиевые петли. 118
Ьсли фермент встречает на своем пути определенную нуклеотидную последовательность, называемую х-сайтом, он вносит в нее одноцепочечный разрыв. В результате одна из петель превращается в длинный однонитиевый «хвост», который может быть использован гесА белком для инициации гомологичной рекомбинации.
