Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
экстракты смешивают и анализируют в одном и том же двумерном геле. После
фиксирования и импрегнирования ППО гель высушивают и проводят
флюорографию, как было описано выше. Пятна на флюорограмме образуются за
счет совместного действия фотонов, порождаемых распадом ядер 14С и 3Н.
После этого гель закрывают плотной черной бумагой, которая задерживает
как фотоны, так и мягкое p-излучение трития, и проводят радиоавтографию.
На полученной таким образом радиоавтограмме проявляются только пятна,
порождаемые более жестким p-излучением от |4С. Сравнение флюорограммы и
радиоавтограммы позволяет сопоставить наборы генных продуктов различных
клеточных линий.
Аналогичные методики были описаны в работах McConkey, 1979, и Walton et
al., 1979. Наконец, была разработана еще одна методика, основанная на
применении цветной негативной пленки (Kronenberg, 1979). Эта пленка
покрыта тремя слоями фотографической эмульсии, каждый из которых
чувствителен к одному из трех дополнительных цветов - красному, зеленому
или синему. Глубина проникновения излучения в толщу желатиновой эмульсии
зависит от энергии испускаемого излучения. Таким образом, в зависимости
от проникающей способности излучения разные цветочувствительные слои
экспонируются в неодинаковой степени, что соответствует проявлению пятен
с разной окраской.
При достаточно высокой радиоактивности в геле его можно анализировать в
искровой камере типа Radiochromatogramm Camera, модель 2105 фирмы LKB,
или аналогичной камере фирмы Birchover Instruments Ltd. Недавно было
продемонстрировано, что традиционные сканирующие устройства для
обнаружения радиоактивности в тонком слое, типа Packard Radiochromatogram
Scanner, подходят и для сканирования тонких полиакриламидных гелей,
содержащих образцы с достаточно высокой радиоактивностью (обычно не менее
0,4 мкКи на зону) (Righetti, Chrambach, 1978; Magnusson, Jackiw, 1979).
Для количественного определения меченых белков после ИЭФ по-прежнему
наиболее широко применяется метод разрезания геля на сегменты,
солюбилизации их содержимого и определения радиоактивности с помощью
сцинтилляционного счетчика. Весьма удобный метод разделения
цилиндрических гелей на фракции описан в работе Bagshaw et al., 1973. В
качестве трубки для полимеризации геля используют цилиндр от тонкого
пластикового шприца. После ИЭФ на шприц надевают иглу (№ 20) с обрезанным
кончиком, сверху гель закрывают резиновой прокладкой. С помощью дозатора
типа Hamilton Repeating Dispen-
Аналитическое ИЭФ
237
сег, управляющего ходом плунжера, содержимое шприца выдав-ливают через
иглу порциями по 10 мкл. Сцепление полиакриламида со стенками
пластикового шприца минимальное, благодаря чему при таком
фракционировании геля белковые зоны почти не искажаются. Помимо этого
способа для фракционирования цилиндрических гелей пользуются устройствами
типа яйцерезки (Heiderman, 1965; Chrambach, 1966) или блоком с
установленными в ряд бритвенными лезвиями (Matsumura, Noda, 1973).
Описано приспособление для разрезания гелей с помощью ирисовой диафрагмы
(Peterson et al., 1974). Оно позволяет разрезать гель на сегменты с
точностью 13-34% без замораживания или какой-либо другой предварительной
обработки. По-видимому, некоторые из упомянутых устройств (во всяком
случае, первого и второго типа) с небольшими модификациями можно
использовать и для разрезания плоских гелей. После разрезания геля
максимальная эффективность счета радиоактивности достигается только при
полной элюции белков из геля. Для солюбилизации полиакриламидных гелей,
сшитых бис, используют перекись водорода (Goodman, Matzura, 1971). Гели
на основе ЭДА разжижаются при щелочной обработке (Paus, 1971), а гели на
основе БАЦ - под действием меркаптоэтанола (Hansen et al., 1980) (см.
также разд. 3.2.3). Напомним еще раз, что для сшивания гелей не следует
пользоваться ДАТД, поскольку он является ингибитором полимеризации.
3.3.5. Иммунологические методы
Методы, основанные на последовательном проведении ИЭФ и какого-либо из
вариантов иммуноэлектрофореза, так же как и другие виды двумерного
фракционирования, описаны в разд.
3.4.1. Здесь же мы рассмотрим применение метода иммунодиффузии после
ИЭФ, который можно считать одним из способов обнаружения сфокусированных
белковых зон. Регистрацию белков с помощью иммунопреципитации
специфическими антителами лучше всего проводить после ИЭФ в небольших
цилиндрических гелях диаметром около 1 мм, что позволяет свести к
минимуму расход соответствующей антисыворотки. По окончании ИЭФ гель
погружают в пробирку, содержащую необходимый объем раствора
антисыворотки. Иммунодиффузия протекает в течение нескольких часов
(Carrel et al., 1969). Линий преципитации проявляются в виде
опалесцирующих колец на поверхности геля. Полиакриламидная матрица, судя
по всему, не препятствует образованию специфических комплексов антиген -
антитело. Вероятно, это объясняется тем, что большая часть белка
