Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
пленкой (чувствительной к синей области спектра). Таким образом,
благодаря относительно высокой проникающей способности света удается
решить проблемы, связанные с низкой проникающей способностью р-частиц,
которые в обычных условиях поглощаются материалом матрицы и образца.
Последовательность основных операций при флюорографической регистрации
радиоактивности в геле приведена в табл.
3.6. Метод может применяться в случае как фиксированных и окрашенных,
так и нефиксированных гелей. При вымачивании в диметилсульфоксиде (ДМСО)
происходит частичная десорбция кумасси синего с белковых зон, так что
слабо окрашенные полосы могут в конце концов оказаться совершенно
невидимыми. После того как ППО выпадает в осадок, гель становится
непрозрачным, а белковые зоны плохо различимыми. Поэтому фотографировать
окрашенный гель лучше перед его подготов-
Аналитическое ИЭФ
233
Таблица 3.6. Основные операции при флюорографии гелей (Hames, 1981)
1. Сразу после электрофореза или после окрашивания и удаления фона гель в
течение 30 мин вымачивают в 20-кратном объеме ДМСО и затем еще 30 мин в
свежей порции ДМСО1). Эти две порции растворителя можно хранить по
отдельности и использовать (в той же последовательности) несколько раз
для вымачивания других гелей. Однако многократное использование одного и
того же растворителя нежелательно, поскольку, для того чтобы ППО мог
эффективно проникать в гель, из него следует удалить практически всю
воду.
2. Гель погружают в 4-кратный объем 20%-ного ППО в ДМСО на 3 ч2).
3. Затем гель переносят на 1 ч в 20-кратный объем воды. При этом ППО,
растворимый в ДМСО, но нерастворимый в воде, выпадает в осадок и гель
становится непрозрачным.
4. Гель высушивают под вакуумом (разд. 3.2.15)3).
5. На гель накладывают рентгеновскую пленку, экспонируют при -70 °С.
Наиболее чувствительна пленка Kodak X-Omat R, XR1. Если ее нет в наличии,
можно применять и несколько менее чувствительную пленку Fuji РХ.
Неэкранированные рентгеновские пленки Kodirex и Kodak, широко применяемые
для радиоавтографии, малочувствительны к видимому свету и поэтому для
флюорографии не используются. *
6. По окончании экспонирования форму держат в собранном виде, пока она не
прогреется до комнатной температуры (во избежание появления вуали), затем
пленку вынимают и проявляют обычным способом, согласно соответствующей
инструкции.
*) Для гелей, содержащих менее 2% акриламида в сочетании с 0,5%-ной
агарозой, вместо ДМСО используют метанол. После электрофореза гель в
течение 30 мин вымачивают в 20 объемах метанола. Затем гель на 3 ч
помещают в 10%-ный раствор ППО в метаноле, после чего высушивают под
вакуумом без нагревания. а) Избыток ППО можно извлечь из оставшегося
раствора, добавляя к нему 3 объема 10%-ного этанола. Выпадает осадок,
который спустя 10 мин отделяют фильтрованием, промывают 20 объемами воды
и высушивают на воздухе.
8) Растрескивания геля при сушке можно избежать, вымочив его в растворе
метанола (до 30%), содержащем 3% глицерина, непосредственно перед
высушиванием.
кой к флюорографии. Для сопоставления флюорограммы с обычной картиной
окрашивания белков высушенный гель можно по периметру пометить
радиоактивными чернилами до наложения рентгеновской пленки. К сожалению,
без проведения предварительной специальной обработки рентгеновской пленки
интенсивность образующихся при флюорографии пятен оказывается не
пропорциональной содержанию метки в соответствующих белковых зонах. При
этом зонам с низкой -радиоактивностью соответствуют слишком слабые пятна
на флюорограмме. Проблема может быть решена благодаря предварительному
слабому засвечиванию пленки с помощью яркой короткой световой вспышки
(продолжительностью <1 мс). Методика контролируемого предварительного
засвечивания пленки приведена в табл 3.7 (Laskey, Mills, 1975). Такое
засвечивание пленки до Л540 = 0,1-0,2 приводит к тому, что поглощение в
пятнах после флюорографии становится пропорциональным радиоактивности
образцов, а чувствительность метода по сравнению е прямой
234
Глава 3
радиоавтографией еще более повышается и достигает 400 расп./(мин-см2) для
14С или 35S и 8000 расп./(мин*см2) для 3Н. Следует еще раз подчеркнуть,
что только после такого предав арительного засвечивания пленки профиль
поглощения на флюорограмме соответствует истинному распределению
радиоактивности в геле. Поэтому для количественной флюорографии всегда
используют пленки, засвеченные до А540^0,15. При более интенсивном
засвечивании (выше 0,2 ед. Л540) чувствительность пленки при флюорографии
3Н, 14С или 35S становится еще более высокой, однако при этом
утрачивается пропорциональность между поглощением и радиоактивностью. В
работе Chamberlain, 1979, предлагалось использовать в качестве
флюоресцирующего агента салицилат натрия вместо ППО. Важнейшим
преимуществом салицилата помимо значительно более низкой стоимости
является то, что он растворим в воде. Благодаря этому отпадает
