Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
высокомолекулярных субстратов. Получение отпечатка, а при необходимости
окрашивание и удаление фона отнимает очень немного времени. Мембраны
этого типа весьма прочны и просты в обращении (Righetti et al., 1978).
Когда нет возможности использовать метод гистохимического окрашивания,
биологическую активность сфокусированных белков можно определять в
элюатах из геля, разрезанного на тонкие сегменты с помощью одного из
приемов, описанных в
248
Глава 3
разд. 3.3.4. Ясно, что в настоящей книге невозможно достаточно полно
осветить все возможные варианты применения метода зимограмм. Перед нами
стояла задача привести только некоторые характерные примеры,
иллюстрирующие возможности этого широко распространенного метода. Более
подробная информация по применению метода зимограмм в сочетании с
электрофоретическими методами разделения содержится в обзорах Gabriel,
1971; Shaw, Prasad, 1970, и Siciliano, Shaw, 1976. В прекрасном
практическом руководстве "Пособие по применению электрофореза ферментов
для изучения генетики человека" (Harris, Hopkinson, 1976), а также в
дополнениях к нему, изданных в 1977 и 1978 гг., много внимания уделено
использованию метода зимограмм, приведены подробные прописи и методики.
Благодаря значительно более высокой разрешающей способности ИЭФ с его
помощью удается зарегистрировать значительно более высокий уровень
полиморфизма сывороточных и тканевых белков, чем в случае обычного
зонального или диск-электрофореза. ИЭФ становится одним из основных
методов популяционной генетики и криминалистической серологии (см.
например, Kuhnl et al., 1977а,b,с; 1978; 1979; Kuhnl, 1979, 1981). На
рис. 3.25 приведен пример, позволяющий сравнить данные по частоте
полиморфизма, полученные с помощью электрофореза и ИЭФ. Благодаря
применению ИЭФ удалось обнаружить много новых аллельных форм белков,
микрогетерогенность которых уже была установлена ранее, а также выявить
наличие полиморфизма белков, которые, согласно прежним данным, считались
представленными единичными формами.
3.4. Методы двумерного фракционирования
Было подсчитано (Giddings, 1969), что, несмотря на высокую разрешающую
способность электрофоретических методов, число теоретических тарелок,
эквивалентное одному электрофоретическому эксперименту (при разумных
значениях длины пути, падения напряжения, с учетом реальных коэффициентов
диффузии), составляет около 2000. Соответственно ни один из
электрофоретических методов сам по себе не позволяет полностью разделить
все компоненты сложных белковых смесей. В особенности это относится к
фракционированию белков физиологических жидкостей, для которых
молекулярная масса и содержание отдельных компонентов варьируют в
пределах трех порядков при относительно небольших вариациях в суммарном
заряде и свободной электрофоретической подвижности. Повышение загрузки
образцом, как правило, не помогает обнаружить минорных компонентов,
которые в этом случае проявляются в виде едва заметных "плечиков" или
искажений на симметричных
Аналитическое ИЭФ
249
гауссовых кривых распределения основных компонентов. Поэтому
представляется весьма логичным сделать следующий шаг и ввести двумерное
фракционирование, которое должно обеспечить максимальное расхождение
белковых пятен и более или менее равномерное распределение их по рабочей
поверхности двумерного геля. При этом можно получить белковую карту, на
которой каждое индивидуальное пятно будет однозначно определяться двумя
координатами, отражающими физико-химические характеристики индивидуальных
белковых компонентов (например, пары значений pi-Мт целого белка, pi-Мх
субъединицы или Мг целого белка-Мг субъединицы и т. п.). Если стремиться
к тому, чтобы в результате двумерного фракционирования белковые пятна
оказались достаточно равномерно распределенными по всей поверхности, а не
выстраивались по диагонали геля второго направления, то желательно, чтобы
в основе процессов разделения в первом и во втором направлениях лежали
существенно разные принципы фракционирования. Такой подход довольно
эффективно реализуется при получении пептидных карт с помощью
электрофореза и хроматографии на бумаге (метод "отпечатков пальцев"),
когда в первом направлении происходит разделение пептидов по заряду, а во
втором - по коэффициенту распределения между подвижной (органической) и
неподвижной (водной) фазами. Двумерное электрофоретическое
фракционирование белков можно проводить таким образом, чтобы их
разделение в первом направлении было основано только на различии в заряде
(или "свободной" электрофоретической подвижности), а во втором - на
различии в размере молекул (или наоборот). При такой постановке опыта
можно ожидать, что белковые пятна будут равномерно распределены по всей
поверхности геля.
В одной из первых работ по двумерному фракционированию белков (Smithies,
Poulik, 1956) использовался электрофорез на бумаге с последующим
электрофорезом в крахмальном геле в перпендикулярном направлении. Позднее
