Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
Анионные детергенты ^ -S-0" Na* 6 О НО 'чу^А"0'Ма+ Додецилсульфат натрия
Холат натрия
Ж
Дезоксихолат натрия (ДОХ)
о Таурохолаг натрия
Катионные детергенты ^ Цетилтриметиламмонийброг* (цетавлон)
Цвиттерионные детергенты о О , О НО rt0 ' S Цвиттергент 3*14 ХАПС
но-МДэн 0 у,. Лизофосфатидилхолин
Неионные детергенты Луброл РХ
(о-с н2- С Н2) - ОН Тритон Х-100
(о-сн2-сн2)-он Тритон N*101
' сн s Аммоникс L0
УЧ'у он*. ¦Glc-Glc-Gal-Xyl Дигитонин
'сн-он № Октилглюкозид •
Рис. 4.3. Структурные формулы некоторых наиболее распространенных
детергентов, в том числе цвиттерионных и неионных детергентов, пригодных
для использования при ИЭФ. ХАПС - 3-[(-холамидопропил) диметиламмоний]-1-
пропилсульфонат. (Hjelmeland, Chrambach, 1981.)
19-1488
290
Глава 4
не гидрофобные мембранные белки могут оказаться полностью включенными
внутрь мицелл тритона, что приведет к образованию комплексов с очень
большим значением стоксова радиуса. Один из примеров образования такого
рода структур проиллюстрирован на рис. 4.4 (Hackenberg, Klingenberg,
1980). Видно, что димерный белок - переносчик ADP и АТР из митохондрий
сердца полностью включен в эллипсоидную мицеллу со стоксовым радиусом 6,5
нм, содержащую около 150 молекул тритона. Миграция к изоточке таких
крупных эллипсоидных частиц будет
Рис. 4.4. Геометрическая модель комплекса карбоксиатрактилат (КАТ)-бе-
лок-тритон. Предполагается, что молекула белка полностью входит внутрь
эллипсоидной мицеллы, состоящей примерно из 150 молекул тритона и около
16 фосфолипидных остатков. Из-за увеличения размера малой оси эллипсоида
значение стоксова радиуса мицелл тритона при включении белка возрастает
от 5,3 до 6,5 нм. (Hackenberg, Klingenberg, 1980.)
Общие экспериментальные аспекты
291
сильно затруднена, особенно при проведении ИЭФ в матрице с выраженными
молекулярно-ситовыми свойствами. Кроме того, было обнаружено, что
подобные детергенты связываются с ам-фолитами-носителями, особенно в
щелочном диапазоне pH (Gianazza et al., 1979), поэтому при окрашивании
геля приходится проводить длительное вымачивание в смеси ТХУ-изо-,
пропанол для разрушения и вымывания мицелл детергента. Методы быстрого
окрашивания (коллоидный раствор СВВ G-250 в 12%-ной ТХУ) для
детергентсодержащих гелей непригодны, поскольку тройной комплекс
краситель-детергент-ам-фолиты необратимо выпадает в осадок прямо в геле
(Righetti, Chillemi, 1978). Интересно было бы попытаться использовать
другие детергенты, например типа октилглюкозида, обладающего очень
небольшой мицеллярной массой - около 2000-3000 (Helenius, Simons, 1975;
Tanford, Reynolds, 1976).
Для диссоциации прочных комплексов успешно использовались такие
дезагрегирующие агенты, как 50%-ный диметил-
Молярность
Рис. 4.5. Зависимость прочности комплексов амфолин-краситель от
содержания диссоциирующих добавок. Кривые плавления снимали на
регистрирующем спектрофотометре Gilford Model 2400 в режиме
контролируемого повышения температуры на 1,0 °С за 1 мин при длине волны
585 нм. К растворам с постепенно нарастающей концентрацией каждого из
пяти исследуемых диссоциирующих агентов добавляли краситель Benzo New
Blue 5BS (30 мкг/мл). Тпл комплекса амфолины-краситель, полученная путем
экстраполяции к нулевой концентрации диссоциирующих добавок, равна 87 °С.
# -диметил-
формамид, ¦ - формамид, О - диметилсульфоксид, V - мочевина,
А_______________
тетраметилмочевина. Наиболее эффективными диссоциирующими агентами ока"
зались диметилформамид и тетраметилмочевина. (Righetti et al., 1977.)
19*
292
Глава 4
сульфоксид (ДМСО), 50%-ный диметилформамид (ДМФ), 50%-ная
тетраметилмочевина (ТММ) и формамид (ФА) в кон-центрации до 90% (Righetti
et al., 1977). При ИЭФ содержание любого из этих агентов, за исключением
ФА, не должно превышать 50%, поскольку при более высоких концентрациях
начинается преципитация амфолинов. В случае ИЭФ в ПААГ концентрация ДМФ и
ТММ не должна превышать 30-35%, так как при более высоком содержании эти
вещества препятствуют полимеризации геля. Для диссоциации комплексов типа
амфоли-ны-краситель наиболее эффективны ДМФ и ТММ, а наименее эффективным
агентом оказывается ФА (при одинаковых молярных соотношениях; см. рис.
4.5). Тем не менее ФА можно било бы считать весьма полезным
дезагрегирующим компонентом, поскольку при концентрации до 95% он не
препятствует полимеризации геля и не вызывает преципитации амфолинов. К
сожалению, ФА подвержен быстрому гидролизу у катода с образованием
свободных аммиака и муравьиной кислоты, которые препятствуют нормальному
формированию градиента pH и фокусированию образцов.
4.3. Внесение образца
Ранее мы подробно останавливались на способах внесения образца в случае
ИЭФ в циллиндрических (разд. 3.2.10) и плоских (разд. 3.2.14) гелях и
вкратце - в случае ИЭФ в вертикальной колонке со стабилизацией градиентом
сахарозы (разд.
2.1.1). В настоящем разделе будут дополнительно рассмотрены некоторые
методические аспекты внесения образца для последнего варианта. Образец
