Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
различного рода добавки (разд. 4.2). В тех случаях, когда все же не
удается подавить изоэлектрическую преципитацию, можно воспользоваться
некоторыми приемами, позволяющими избежать ее нежелательного влияния на
фракционирование в вертикальном градиенте плотности. Один из этих приемов
связан с выбором такой полярности электродов, при которой выпадающие в
осадок (примесные) компоненты фокусируются в нижней части колонки, а
фокусирование искомого белка происходит вне зоны преципитации, как можно
ближе к верхней части колонки. В этой ситуации обычный способ опорожнения
колонки (т. е. элюция через низ) не подходит, поскольку осадок может
забивать сливную трубку, а искомые белковые зоны могут заметно
размываться. Более приемлемым в этом случае представляется извлечение
сфокусированного образца через верх колонии. Эта операция, легко
осуществимая при работе с колонками
28а
Глава 4
фирмы LKB, схематически показана на рис. 4.1. По окончании ИЭФ отключают
ток и перекрывают нижний клапан, соединяющий тяжелый электродный раствор
с центральным платиновым электродом (см. рис. 2.2). Через верхнее
отверстие, предназначенное для наслаивания градиента, в колонку вводят
трубочку на 1 см ниже верхнего электрода й откачивают верхний электродный
раствор. Для извлечения образца используют другую пластиковую трубочку,
которую перед введением в колонку фланцуют с помощью металлического
стержня, заточенного под углом 60°, слегка нагревая конец трубочки на
пламени спички или зажигалки. Нагревая таким же образом трубочку на рас-
Общие экспериментальные аспекты
Рис. 4.1. Элюция после ИЭФ, сопровождающегося изоэлектрической
преципитацией, в вертикальном градиенте плотности в колонке фирмы LKB.
Рассматривается вариант извлечения компонентов, фокусирующихся вне зоиы
преци- ч питации (Л). В этом случае проводят ступенчатую элюцию начиная с
верхних ¦слоев, через U-образную трубочку, расширяющуюся под углом 60° на
конце. Эту трубочку вводят через верхний отросток колонки (обозначенный
цифрой 5 на рис. 2.2) и погружают на глубину около 5 мм в слой градиента.
С домощью еще одной трубочки поверх градиента наслаивают слой воды
толщиной 5 мм (5). После этого, как показано на рис. Л, первую порцию
градиента откачивают с помощью перистальтического насоса со скоростью
100- 120 мл/ч. Эту процедуру повторяют необходимое число раз. На рис. В
приведены два примера фракционирования. - pH, • Л2ао, О А^о. (С любезного
разрешения LKB Produkter АВ.)
стоянии 1 см от края, ее загибают в форме U-образной петли. Петлю
опускают в колонку на 5 мм ниже уровня элюируемой жидкости. Для того
чтобы обеспечить полное смывание образца со стенок колонки, перед
извлечением каждой фракции поверх нее с помощью первой трубочки
наслаивают 5-мм слой дистиллированной воды. Через петлю откачивают 5-мм
слой градиента и покрывающий его 5-мм слой воды с помощью
перистальтического насоса со скоростью 120 мл/ч. После этого п^тлю
опускают еще на 5 мм, снова наслаивают 5-мм слой воды и откачивают еще
одну порцию. Эти операции повторяются многократно, до тех пор пока не
будут извлечены все нужные фракции. Дополнительные экспериментальные
подробности приведены в методическом руководстве фирмы LKB I-8100-E04.
Этот прием был использован в работе Janson, 1972, где после фокусирования
7,3 г белка в колонке фирмы LKB объемом 440 мл с помощью ступенчатой
элюции "через верх" удава-
Глава 4
Рис. 4.2. Извлечение из колонки образцов, которые при ИЭФ в градиенте
плотности подвергаются изоэлектрическом преципитации. Во внутреннее
пространство колонки при сборке вводят кольцо из перфорированной
стеклянной трубки с отводом (Л). Кольцо помещают в верхней части колонки
или в предполагаемой области преципитации (?). По мере появления осадка
его откачивают через трубочку, присоединенную к отводу кольца. 1 - к
насосу, 2 - нижний электрод, 3 - трубочка, 4 - верхний электрод, 5 -
отвод, 6 - перфорированное кольцо, 7 - рубашка внутреннего охлаждения, 8
- рубашка наружного охлаждения. (Rathnam, Saxena, 1970.)
лось с хорошим разрешением выделить три изоформы а-глюко-зидазы из
Cytophaga johnsonii. Характерно, что ИЭФ в данном случае было самым
первым препаративным этапом выделения ферментов, и тем не менее только с
его помощью удалось достичь 300-кратной очистки (от неактивных белков) с
выходом по а-глюкозидазной активности около 20%. Впрочем, иногда
экспериментатору приходится сталкиваться и с обратной задачей, т. е. не с
элюцией растворимого белка в присутствии пре-ципитирующих примесей, а с
извлечением белка, который сам подвергается изоэлектрической
преципитации. Остроумное решение такой задачи было предложено в работе
Rathnam, Saxe-
Общие экспериментальные аспекты
285
па, 1970. Белки, преципитирующие в ходе ИЭФ, извлекаются с помощью
введенного внутрь колонки кольца из стеклянной, трубки с отверстиями
[рис. 4.2,Л]. В той части кольца, которая примыкает к точке соединения с
