Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ригетти П. -> "Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение" -> 119

Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.

Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение — М.: Мир, 1986. — 399 c.
Скачать (прямая ссылка): izoelektricheskoefokusirovanie1986.djvu
Предыдущая << 1 .. 113 114 115 116 117 118 < 119 > 120 121 122 123 124 125 .. 171 >> Следующая

вертикальной трубкой, отверстия имеют наименьший диаметр. По мере
удаления от этой точки диаметр отверстий постепенно увеличивается таким
образом, чтобы обеспечить одинаковую скорость всасывания жидкости по
всему периметру кольца. Вертикальная трубка припаяна под небольшим тупым
углом к плоскости кольца, что помогает сохранить его горизонтальное
положение при перемещении вверх и вниз по колонке. Как показано на рис.
4.2,5, при сборке колонки кольцо следует помещать около верхнего
электрода, а еще лучше в предполагаемой области преципитации. По мере
появления осадка в ходе ИЭФ его отсасывают через трубку, присоединенную к
кольцу. С необходимыми предосторожностями эту операцию можно проводить,
не отключая напряжения, чтобы не вызвать искажений на других участках
градиента. Если уровень верхнего электродного раствора начнет опускаться
ниже платинового электрода, то через другую трубочку можно залить
дополнительную порцию электролита. Обе эти операции можно проводить
одновременно.
При ИЭФ в горизонтальном слое с "капиллярной" стабилизацией при помощи
гранулированных матриц типа сефадекса, полиакриламида, агарозы или
Pevikon (см. разд. 2.2.3) изоэлектрическая преципитация не представляет
столь серьезной опасности. В то же время следует иметь в виду, что при
обычных для ИЭФ низкой ионной силе и высокой белковой загрузке
преципитация белка может происходить в интервале ± 7г ед, pH от истинного
значения pi, что соответственно может привести к "размыванию" зон и
ухудшению разрешения. Более того, в отдельных случаях образующийся
плотный осадок может забить поры в геле, что приведет к неравномерному
распределению электрического поля и искажению сфокусированных зон. В
принципе изоэлектрическую преципитацию можно отчасти подавить, проводя
ИЭФ при высокой концентрации соли (до 0,1М NaCl), как было предложено в
работе Righetti, Chrambach, 1978. Однако для этого необходимы большие
электродные резервуары, обеспечивающие постоянное обновление
электролитов. Предлагалось также использовать полиакриламидный гель,
полученный при сополимеризащии с цвиттерионами типа MAPS [внутренняя соль
(3-сульфопропил) диметил (3-метакриламидопро-пил) аммония) (Hjelmeland et
al., 1981). Все же следует отметить, что это включенное в состав геля
вещество вряд ли способно действительно увеличить ионную силу или
сбалансировать процесс ИЭФ по току. Наилучшим способом, позволяющим
контролируемо повышать ионную силу в геле и свести к мини-
286
Глава 4
муму изоэлектрическую преципитацию даже при значительной белковой
загрузке, является проведение ИЭФ в иммобилизованном градиенте pH (см.
разд. 1.11.7) (Bjellqvist et al., 1982а,b).
4.2. Некоторые добавки при ИЭФ
Изоэлектрическую преципитацию часто удается полностью или частично
подавить при введении соответствующих добавок (Vesterberg, 1970).
Некоторые из них помимо стабилизации и солюбилизации сфокусированных зон
уменьшают различия в осмолярности по всему градиенту, возникающие за счет
фокусирования амфолитов. Повышая общую осмолярность среды, добавки такого
рода снижают опасность образования слоя "чистой воды". Для солюбилизации
белков использовались мочевина и формамид в концентрации до 4 М. Однако
при использовании этих добавок следует проявлять определенную
осторожность, поскольку они могут заметно изменить физико-химические
свойства некоторых, в особенности мультимерных, белков. С успехом
применяются также неионные детергенты в концентрации от 0,1 до 5%.
Использование детергентов особенно эффективно для поддержания
растворимости мембранных белков. Б настоящее время под различными
коммерческими наименованиями выпускается целый ряд детергентов этого
типа, таких, как Tween 80, Emasol,Brij39,TritonX-100 (SigmaChemical Co.).
Для солюбилизации сывороточных липопротеинов применяли 33%-ный
этиленгликоль (Kostner et al., 1969) или тетраметил-мочевину (Gidez et
al., 1975). В некоторых случаях предлагалось использовать комбинации
нескольких добавок (Wadstrom,
1975). Оказалось, например, что совместное применение мочевины и тритона
Х-100 весьма эффективно при фокусировании мембранных белков эритроцитов.
Аналогичные результаты были получены и в работе Bhakdi et al., 1975.
Подчеркивалась также необходимость использования высокоочищенных
детергентов, поскольку примеси, которые содержатся во многих препаратах
неионных детергентов, могут отрицательно сказываться на ходе
фракционирования (Wadstrom, 1975). Так, в случае детергентов типа тритона
Х-100 автор предложил использовать продукт фирмы Serva категории
"сцинтилляционный". На сегодняшний день совместное применение 9М мочевины
и 2%-ного нонидета NP-40 или тритона Х-100 является широко
распространенной процедурой при ИЭФ сложных смесей клеточных или
мембранных белков, особенно на первом направлении двумерного
фракционирования (O'Farrell, 1975; Whalen et al., 1976; Friesen et al.,
1976; Zechel, 1977; Schmidt-Ullrich, Wallach, 1977). Мочевина
Предыдущая << 1 .. 113 114 115 116 117 118 < 119 > 120 121 122 123 124 125 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed