Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение - Ригетти П.
Скачать (прямая ссылка):
способствует диссоциации агрегатов и субъединичных структур, а также
раскручиванию полипептидных цепей и тем самым вы-
Общие экспериментальные аспекты
287
свобождению нековалентно связанных кофакторов. Неионные детергенты
ответственны преимущественно за разрушение гидрофобных контактов.
По сообщению Jacobs, 1971, дополнительные проблемы при ИЭФ могут
возникать из-за окисления цистеина и метионина до цистеиновой кислоты и
метионинсульфоксида. Этого можно избежать, проводя ИЭФ в присутствии
антиоксидантов, таких, как тиодигликолевая или аскорбиновая кислоты. Судя
по всему, последняя является более эффективным антиоксидантом, а также
предотвращает возможные химические модификации остатков тирозина и
аргинина (Jacobs, 1973). В случае тиолзависи-мых ферментов их активность
удается сохранить, работая в присутствии низких концентраций (около 10-4
М) меркаптосоеди-нений (Wadstrom, Hisatsune, 1970а,b). Для этих целей с
успехом использовали 2-меркаптоэтанол, 2,3-димеркаптопропанол и
дитиотреитол или его изомер дитиоэритритол (Cleland, 1964). Было
установлено (Allen, Huphries, 1975), что при работе с оболочками жировых
капелек молока или с мембранами эритроцитов человека целесообразно
включать в состав сахарозного градиента плотности цвиттерионные
поверхностно-активные вещества, например алкилбетаины типа Empigen ВВ:
СНз
I
R-N+-СН2-COO- (R=Cio-Cie)
I
СНз
(поставляется отделением Marchon Division фирмы Albright, Wilson Ltd.)
или сульфобетаины типа Sulphobetaine DLH:
СНз
R-N+-СН2-СН2-S03" (R = Cu)
I
СНз
(поставляется фирмой Texilana Corp.). Эти детергенты весьма эффективно
солюбилизируют мёмбраны при низких^ концентрациях (5-30 мМ или 0,1-0,5%)
в очень мягких условиях. Они, как правило, не инактивируют ферменты
(исключение составляет ацетилхолинэстераза из эритроцитов, которая
инактивируется бетаиновым детергентом, но при этом устойчива к сульфо-
бетаинам). Устойчивость ферментов по отношению к цвитте-рионным
детергентам выгодно отличает последние от анионных детергентов типа ДДС-
Na, оказывающих сильное денатурирующее воздействие на любые белки.
Цвиттерионные детергенты можно использовать в сочетании с ИЭФ, поскольку
их рабочая
288
Глава 4
концентрация может быть достаточно мала; молекулы этих реагентов в целом
электрически нейтральны, рК заряженных групп находятся вне пределов
обычного интервала фокусирования pH 3-10. При анализе полиморфизма шести
компонентов системы комплемента с помощью гелевого ИЭФ (Alper et al.,
1975) в гель вводили 0,2 М таурин. Таурин (NH3+-СН2-СН2- SO3-) также
имеет цвиттерионную природу, он не заряжен во всем рабочем диапазоне pH
фокусирования и, таким образом, может повышать осмотическое давление в
геле, практически не сказываясь на общей концентрации электролитов или на
вязкости жидкой фазы. Недавно было предложено использовать смесь неионных
и цвиттерионных детергентов для полной солюбилизации мембранных белков.
Так, в работе Hjelmeland et al., 1979, микросомы печени солюбилизировали
в 1%-ном тритоне Х-100 и 1%-ном SBu (Ы-тетрадецил-N, N-диметил-З-амино-Ь
пропансульфоновая кислота, или zwittergent ТМЗ-14 фирмы Calbiochem) и
фокусировали растворенные белки в геле, содержавшем по 0,05% каждого из
этих детергентов. При помощи этой смеси детергентов удается добиться
полной солюбилизации мембранных белков, которая, судя по всему,
сопровождается частичной потерей их биологической активности. Это
противоречит прежним данным (Allen, Humphries, 1975), которые, как можно
думать, были получены с применением слишком низких концентраций SBu,
недостаточных для полного растворения мембранных белков. Согласно данным
Gonenne, Ernst, 1978, для полной солюбилизации соотношение детергент:
белок должно превышать 10: 1. Денатурирующее действие SBu, так же как и
других представителей класса н-алкил-цвиттерионов, определяется гибкостью
углеводородного "хвоста" молекулы детергента (Hjelmeland et al., 1978).
На рис. 4.3 приведены структурные формулы наиболее распространенных
неионных и цвиттерионных детергентов, которые можно использовать для ИЭФ
(Hjelmeland, Chrambach, 1981). Детергенты класса тритонов характеризуются
довольно низким значением критической концентрации мицеллообразования
(0,075 мМ для тритона N-101 и
0.240 мм для тритона Х-100), высокой степенью агрегации (140- 150 молекул
на мицеллу) и соответственно высокой массой мицелл (90000 для тритона Х-
100), а также значительным стоксовым радиусом (5 нм для мицелл тритона).
Таким образом, при фокусировании в 9М мочевине и 2%-ном тритоне Х-100
(или NP-40) следует учитывать, что вязкость такого раствора очень высока,
а, следовательно, скорость миграции компонентов по направлению к своим
равновесным положениям относительно низка. Поэтому время фокусирования в
этих условиях следует увеличить (по крайней мере вдвое по сравнению со
временем ИЭФ в геле без добавок). Кроме того, край-
Общие экспериментальные аспекты
289
Структурная формула Химическое или торговое название
