Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Если этот процесс пройдет быстро и плавно («разгон» рото-
ра), то границы между слоями на какое-то время останутся четкими. Затем, в ходе вращения ротора при постоянной скорости, вследствие совокупности процессов диффузии и седиментации границы между слоями исчезнут и установится непрерывный равновесный градиент плотности раствора. Профиль этого градиента, как и для бакет-ротора, будет определяться скоростью вращения ротора, исходной плотностью раствора р0 и значениями гмакс и гмин, которые приводятся в описании угловых роторов и отсчитываются так, как показано на рис. 68.
Очень часто пробирки углового ротора заполняют плотным раствором соли не полностью и сверху наслаивают легкое масло. Это делается как' для того, чтобы избежать перегрузки ротора на максимальной скорости вращения, так и для того, чтобы исключить из процесса ориентации градиента область пробирки, прилегающую к ее крышке, где плавность этого процесса нарушается. В таком случае все расчеты профиля градиента, естественно, надо вести исходя из значения гмия для границы между плотным раствором соли и маслом. Из чисто геометрических соображений вытекает следующее соотношение:
. d cos а . У?- ^гр •
Гминп> “Гмт 4 2 + nd*J4
Здесь d — диаметр пробирки, см; IV—полный объем пробирки, мл; V,, — объем градиента, мл; а — угол наклона пробирок в роторе.
Используя эти величины и имея в виду описанную выше картину вертикального смещения слоев различной плотности, приближенные расчеты интервала плотностей Др, времени установления градиента t и времени миграции частиц к положению равновесия можно проводить по тем же формулам, что и для бакет-роторов.
Рассмотрим особенности фракционирования препаратов в угловом роторе. В момент достижения равновесия зоны частиц будут расположены вертикально (рис. 69, а). В ходе остановки ротора произойдет обратная переориентация всего градиента плотности, а вместе с тем и разделенных зон частиц (рис. 69, б). Зоны при этом не нарушатся. Когда пробирка будет вынута из ротора и установлена вертикально для раскапывания градиента, его окончательная ориентация произойдет под действием силы тяжести, а зоны расположатся горизонтально (рис. 69, в). Расстояние между зонами при этом увеличится, что облегчит их фракционирование,
Важно отметить, что из-за наклонного положения пробирки во время вращения ротора длина градиента плотности в направлении действия центробежной силы будет намного меньше, чем для пробирки такого же размера в бакет-роторе. Одновременно площади сечений, перпендикулярных этому направлению, в частности площади зон частиц, будут соответст-
Рис. 68. Обозначение радиусов вращения в пробирке углового ротора (см. текст)
Рис. 69. Изменение расположения слоев жидкости в пробирке при остановке углового ротора
о — во время вращения; 6 — после остановки; в — пробирка, вынутая из ротора
Рис. 70. Переориентация градиента плотности (а — г) при вращении ротора с вертикальными пробирками
венно больше. Вследствие укорочения градиента его формирование заметно ускорится, как и время миграции частиц к положениям равновесия.
Если режимы центрифугирования подобраны так, что изменение плотности на всей длине градиента Др одинаково для углового и бакет-ротора, то зоны частиц в угловом роторе будут уже и расположатся ближе друг к другу в силу большей крутизны градиента. Однако переориентация после окончания центрифугирования переведет их точно в такое же положение, как в бакет-роторе. Выигрыш во времени центрифугирования без изменения разрешающей способности метода сочетается при этом с возможностью использовать большее число пробирок одновременно.
Если же начальные плотности солевых растворов (р0), объемы градиентов и скорости вращения для углового и бакет-ротора одинаковы, то в угловом роторе в силу уменьшения длины градиента значение Др будет намного меньше. После остановки ротора и переориентации градиента картина распределения зон частиц в. угловом роторе будет такой же, как при центрифугировании в пологом градиенте плотности в бакет-ро-торе: зоны окажутся сильно раздвинутыми между собой, хотя
и будут заметно более широкими. Поэтому для разделения близких по плотности компонентов смеси частиц предпочитают использовать угловые роторы. В тех же случаях, когда необходимо разделить частицы, сильно отличающиеся между собой по плавучей плотности, преимущество отДают бакет-роторам.
Центрифугирование в роторах
с вертикальными пробирками
ПровеДенное рассмотрение переориентации градиента в угловых роторах делает возможным ознакомление с крайним случаем такой переориентации — в роторах с вертикально стоящими пробирками. Оказалось, что такие роторы имеют определенные преимущества по сравнению с угловыми и бакет-роторами. Сначала преформируют градиент плотности и его слои располагаются горизонтально (рис. 70, а). По мере плавного разгона ротора до частоты вращения 1 ООО об/мин слои градиента переориентируются .так, что в конце концов распо-лагаются вертикально (б—г). При остановке ротора происходит обратная переориентация градиента и зон частиц, как и в случае углового ротора. Даже в этом, крайнем случае ни гра-диент, ни зоны не искажаются, если остановка ротора производится достаточно плавно. Преимущество быстроты формирования равновесного градиента плотности здесь выражено максимально, так как вся длина градиента укладывается в диаметре пробирки.
