Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование" -> 120

Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование — М.: Наука, 1981. — 288 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforeziultracentrifiguriya1981.djvu
Предыдущая << 1 .. 114 115 116 117 118 119 < 120 > 121 122 123 124 125 126 .. 130 >> Следующая

При планировании и расчете градиента плотности Cs2S04 ввиду его крутизны особое внимание следует уделить проверке
вероятности кристаллизации соли у дна пробирки. Контрольных графиков для Gs2S04 фирма «Beckman» не дает, поэтому приходится проводить прикидочный расчет для оценки диапазона плотности градиента (Ар) и значения р у дна пробирки (см. пример 1 для градиента CsCI). Плотность насыщенного раствора Cs2SOt при 25° равна 2,02 г/см3.
Допустимая загрузка цезиевых градиентов плотности определяется поставленной задачей, и в первую очередь близостью плавучих плотностей разделяемых компонентов смеси. Для ориентировки укажем, что разделение двух типов молекул ДНК, от-
личающихся по плотности на 0,005 г/см3, в градиенте CsCI и угловом роторе с пробирками по 10 мл вряд ли удастся осуществить при загрузке большей, чем 50 мкг ДНК на градиент. В то же время, при отделении ДНК от РНК в градиенте Cs2S04 в таком же роторе суммарную загрузку градиента можно довести до 5 мг.
Приведем несколько примеров использования равновесного центрифугирования в градиенте плотности растворов Cs2SOt.
Пример 1. Разделение ДНК» РНК и белков из ядер фиб-робластов хомячка [MacLeod et al., 1979}.
Очищенные ядра растворяли в 6 М растворе гуанидинхлорида с 10 мМ ЭДТА, pH 7. При этом все нуклеиновые кислоты диссоциировали от связанных с ними белков. Для уменьшения вязкости производили обработку ультразвуком, а углеводы удаляли экстракцией этилацетатом. 2,2 мл ядерного лизата в полиалломерной пробирке ротора SW 50.1 смешивали с 2,8 мл 2,2 М раствора Cs2SO«, содержащего 10 мМ ЭДТА и 9% ДМСО, и центрифугировали при 35 000 об/мин и 20° в течение 40 ч. Три хорошо разделившиеся полосы собирали, проколов пробирку у дна (рис. 72). Нуклеиновые кислоты обнаруживали по УФ-поглощению, белок — по окрашиванию флюоресцамином. Плотность фракции определяли путем взвешивания аликвот по 10 мкл в калиброванных капиллярах.
Проверим опасность кристаллизации Cs2S04 у дна пробирки при такой постановке опыта. Исходная концентрация соли при указанном разбавлении составляет 1,23 М, т. е. 32,8 мае. %. Как следует из приведенных выше данных, этой концентрации соответствует начальная плотность р0=1,36 г/см3. Из табл. 3 интерполяцией находим, что р0=0,71 • 10”. Пробирки ротора SW50.1 заполнены целиком (скорость вращения намного меньше макси-
з
Рис. 72. Разделение РНК, ДНК и белков из ядер фибробластов хомячка равновесным центрифугированием в градиенте плотности
CS2SO4 [MacLeod et al., 1979]
/-РНК (Р-Ьбб г/см*); г-ДНК (1.40
г/см3); 5 —белки (1,23 г/см8)
Дно Длина пробирки Мениск
мальной), поэтому гМйКС= 10.7 см, гтп=6 см (из описания ротора). Подставляя эти значения в соответствующую формулу, находим
_ W,I0‘.35‘(10,7.-61 = „
^ 0,71 -10»
Даже если принять, что в силу нелинейности градиента прирост плотности от исходного значения р0 к максимальному у дна пробирки составляет 0,44 г/см3, то р„акс= 1,36+0,44= 1,8 г/см3. Это значение еще далеко от плотности насыщенного раствора Cs2S04 (2,01 г/см*), способного к кристаллизации.
Кстати, найденное значение Др (0,74 г/см3) позволяет по достоинству оценить выбор градиента и режима центрифугирования в рассмотренном опыте. Диапазон плотностей, в который укладываются все три полосы (считая по основаниям пиков), составляет примерно 0,5 г/см*, т. е. лишь немногим меньше, чем весь диапазон плотностей градиента. В результате полосы распределились по всей длине градиента, обеспечив наилучшее разрешение, но ни одна из них не оказалась в опасной близости от края пробирки.
Пример 2. Разделение фрагментов ДНК фага А,.
Двунитевая ДНК фага А. хорошо изучена. Ее молекулярная масса составляет 32 млн. Отдельные участки этой ДНК резко различаются по содержанию ГЦ-пар.
ДНК дробили по длине в блендоре при 30 000 об/мин до фрагментов сМ«1,5 млн. К раствору этих фрагментов в 5 мМ боратном буфере, pH 9 (5—50мкг/мл), добавляли HgCl2 до молярного отношения Hg2+ к фосфатам ДНК, равного 0,22. Оптимум этого отношения надо подбирать для каждого типа ДНК. Например, для ДНК фага Т2 отношение Hg*+/P=0,35. Затем добавляли Cs2S04 до концентрации 42 мас.%, что соответствует р0=1,5 г/см3. Ионы Hg*+ связываются в указанных условиях преимущественно АТ-богатыми участками, заметно увеличивая их плавучую плотность по сравнению со средним для чистой ДНК-значением р (1,42 г/см3). Центрифугирование вели в роторе «Spinco-50Ti» при 36 000 об/мин в течение 48 ч на холоду. Фракцию ДНК регистрировали по радиоактивности (она была мечена *Н). Получилась четкая картина разделения фрагментов по содержанию ГЦ-пар. АТ-богатые участки располагались ближе ко дну пробирки (рис. 73).
Аналогично, хотя и менее эффективно, можно использовать ионы серебра. Характер их связывания сильно зависит от pH среды. При слегка кислых pH Ag+ связывается только с ГЦ-парами ДНК, а при pH^9,2 — предпочтительно с АТ-парами. К концентрированному раствору ДНК в 5 мМ боратном буфере (pH 9,2) добавляют AgNOs до молярного отношения Ag+/P=0,4, затем приливают концентрированный раствор Cs2SOt с таким расчетом, чтобы конечная плотность составляла 1,5 г/сма, и центрифугируют аналогично предыдущему. Есть указание на то, что
Предыдущая << 1 .. 114 115 116 117 118 119 < 120 > 121 122 123 124 125 126 .. 130 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed