Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
добавлять следует именно раствор Cs2$04. При добавлении сухого сульфата цезия высокомолекулярная ДНК может выпадать в осадок [Cortadas et al., 1979].
Пример 3. Фракционирование по ГЦ-составу с использованием БАМД. Еще более эффективно (по сравнению с ионами ртути) использование в тех же целях ртутного производного, известного под фирменным названием «БАМД» — 3,6-бис- (аце-токсимеркурметил)-диоксан. Оно .также преимущественно вза-
Рис. 73. Разделение фрагментов ДНК фага X по ГЦ-составу равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsjSO* в присутствии ионов ртути [Skalka, 1971]
Цифры над пиками — содержание Г+Ц в процентах
имодействует с АТ-богатыми участками ДНК- Синтез БАМД описан в литературе [Edsall et al., 1954].
НПОС—СН— Hg—сн2—( у-СН2—Hg—сн — соон
БАМД
Сейчас это соединение производится фирмой «Serva» (BAMD). Образование комплекса БАМД с ДНК идет при энергичном перемешивании их растворов в 0,1 М Na2S04 с 5 мМ Na-бората (pH 9,2). Оптимальное молярное отношение БАМД/Р= = 0,18. Начальная плотность раствора Cs2SO* должна составлять примерно 1,47 г/см3. В присутствии Na2SOt и бората соотношение между коэффициентом преломления п25 и плотностью раствора Cs2S04 имеет вид: я25= 1,2636+0,07346р.
С использованием БАМД, например, очищали ГЦ-богатую сателлитную ДНК из тимуса теленка [Cortadas et al., 1977]. Центрифугирование вели в роторе «Spinco-65» при 35 ООО об/мин в течение 60 ч или в роторе «Spinco-ЗО» при 25 000 об/мин в течение 110 ч. Часть ДНК садилась на дно, остальная масса обычной ДНК располагалась вблизи него и только сателлитная (ГЦ-богатая) ДНК выходила отдельным пиком вблизи мениска.
Равновесным градиентным центрифугированием в три этапа удалось разделить сателлитные ДНК из тимуса с плавучими плотностями (в CsCl) 1,706; 1,715 и 1,723 г/см3. На первом этапе использовали центрифугирование в градиенте Cs2S04 с участием БАМД, на втором — с участием ионов Ag+. На третьем
этапе уже хорошо очищенные сателлитные ДНК разделяли равновесным центрифугированием в пологом градиенте плотности раствора CsCl [Streeck, Zachau, 1978].
ГРАДИЕНТЫ ПЛОТНОСТИ ТРИХЛОРАЦЕТАТОВ ЦЕЗИЯ И РУБИДИЯ
Фракционирование РНК в градиентах плотности Cs2S04 имеет ряд недостатков. Уже упоминалось, что высокомолекулярная, а особенно двунитевая РНК легко выпадает в осадок. Эти градиенты характеризуются большой крутизной: для частоты вращения ротора 45 ООО об/мин, р0= 1,6 г/см3 и объема градиента
3 мл при равновесии изменение плотности на каждый сантиметр длины градиента составляет 0,305 г/см3. Однонитевую и двуни-тевую РНК в таком градиенте разделять не удается.
Нейтральный градиент плотности раствора ССГ3СООСз оказывается в тех же условиях намного более пологим — плотность на длине 1 см изменяется всего лишь на 0,171 г/см3. Максимум плотности составляет 1,8 г/см3 (4 М CCl3COCs). РНК не осаждается, одно- и двунитевую РНК удается разделить между собой. Раствор трихлорацетата цезия прозрачен при 280 нм. Рибо-нуклеаза в нем инактивируется, а ДНК и белки отделяются от РНК.
Для приготовления CCl3COOCs раствор продажного препарата Cs2C03 титруют трихлоруксусной кислотой до pH 7, продувая азот, обрабатывают в течение ночи активированным углем при комнатной температуре и фильтруют через миллипоровый фильтр (0,22 мкм). Затем раствор упаривают досуха в пленочном испарителе, белые иглы растирают в порошок и сушат до постоянного веса в вакууме над Р205 при комнатной температуре. Для водных растворов при 25° справедливы следующие соотношения: pa5=7,6232/i25—9,1612 и p25=0,1880C-f-1,0012,
где С —молярная концентрация раствора.
Плавучие плотности некоторых биополимеров в водных растворах CCl»COOCs таковы (в г/см3):
Белок оболочки полиовируса 1,523
ДНК 1,576
Двунитевая (репликативная) РНК полиовируса 1,668 Однонитевая РНК полиовируса 1,756
Для разделения одно- и двунитевой РНК полиовируса с помощью трихлорацетата цезия использовали ротор SW 65 Ti с пробирками по 3 мл, в которых преформировали градиент, образованный пятью степенями по 0,6 мл с
плотностями 1,805, 1,716, 1,625, 1,535 и 1,445 г/см3 [Burke et al., 1978]. Равновесие устанавливалось при частоте вращения 45 000 об/мин за 24—36 ч (без преформирования — втрое дольше). Полиовирус лизировали инкубацией в 3,9 М растворе CCbCOOCs при 50° в течение 1 ч.
Разделение однонитевой и двунитевой РНК происходило весьма успешно, как видно из приведенной в работе седименто-граммы. ДНК и белок также хорошо отделялись от двунитевой РНК- По-видимому, можно отделить и гибрид ДНК — РНК от ДНК и РНК-
CClsCOORb готовят на основе продажного препарата Rb2COs, как было описано для ССЦСООСв. При 260 нм концентрированные растворы ССЦСООИЬ непрозрачны, а при 280 нм 4 М раствор имеет Л280=0,5. Насыщающая концентрация — 5 М. Формулы для выражения плотности (при 25°) через коэффициент преломления (и) или молярную концентрацию (С) имеют следующий вид: р25=6,5869пг5 — 7,7805; р25=0,14480+1,0045. Диапазон изменения плотности в растворах CCIjCOORb— от 1,0 до 1,728 г/см®, а крутизна градиента еще меньше, чем для CGl'sCOOCs. В указанных в начале раздела условиях она составляет примерно 0,156 г/см3 на 1 см.
