Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Длительность центрифугирования надо планировать, ориентируясь на большую из двух величин: времени установления градиента t и времени миграции частиц tH. Ниже это будет проиллюстрировано на конкретных примерах.
Вполне может оказаться, что t^^i. Казалось бы, что в этом случае положение всегда легко исправить увеличением числа оборотов ротора, которое входит в знаменатель выражения для tM в четвертой степени. Но не следует забывать об одновременном увеличении крутизны градиента и возможном вследствие этого ухудшении разрешения полос. Удачным при этом может оказаться двухстадийное центрифугирование. На первой стадии его ведут при максимальной скорости в течение некоторого (сравнительно небольшого) времени, достаточно как для формирования крутого градиента, так и для миграции частиц до их равновесных положений по плотности. Затем число оборотов ротора уменьшают до расчетного значения и выдерживают еще некоторое время, необходимое для перестройки градиента за счет диффузии на расчетную крутизну. Полосы вещества будут расходиться по своим местам на этом новом, более пологом градиенте,' на что потребуется значительно меньше времени, чем при одностадийном центрифугировании, так как они уже сформированы.
В целом время,- затраченное на оба этапа, может оказаться вдвое меньшим, чем при центрифугировании на расчетной скорости в течение всего опыта. При этом необходимо убедиться в том, что на первом этапе, при центрифугировании на максимальной скорости, не произойдет перегрузки ротора и концентрация соли у дна пробирки не превысит предела ее растворимости (р=1,91 г/см3), как было подробно рассмотрено выше.
Выбор соли диктуется в первую очередь соотношением плотностей ее концентрированных растворов и плавучей плотности в них белков и нуклеиновых кислот. Плотности насыщенных растворов наиболее часто употребляемых солей высоки: 2,01 г/см 3 для Cs2SOt, 1,91—для CsCl, 1,9 — для Nal и 1,72— для KI. Вместе с тем ионы этих солей сольватируются — связывают воду, отнимая ее у биополимеров. Плавучая плотность последних сильно увеличивается по сравнению с той, которая
Таблица 4. Плавучая плотность биополимеров в растворах солей, г/см3
Биополимер Содер- Соль
CsCl CSj S04 Nal KI
Нативная ДНК
Cl. perfringens 31 1,692 1,421 1,520 1,488
мыши 40 1,700 1,423 1,522 ---
Е. coli 50 1,710 1,426 1,535 1,500
М. lysodeikticus 71 1,731 1,435 1,551 1,512
Денатурированная ДНК
мыши 40 1,715 1,445 1,574 ---
Е. coli 50 1,725 1,450 1,580 ---
РНК
ядер мыши --- >1,9 1,640 1,62-1,65 ---
рибосом мыши --- >1,9 --- 1,670 1,620
рибосом Е. coli --- >1,9 1,663 --- ---
рибосом дрожжей --- >1,9 --- --- 1,620
Глобиновая мРНК _ >1,9 --- 1,680 ---
Двунитевая РНК реовируса --- >1,9 1,610 1,570 1,570
Гибрид РНК-ДНК --- 1,775 1,485 1,540 ---
Белки --- 1,30-1,33 --- --- ---
Хроматин, фиксированный
НСНО --- 1,384 --- --- ---
Полисомы, фиксированные
НСНО --- 1,51-1,53 --- --- ---
Полисомы -f~ 50 мМ Mg2+ --- --- 1,46-1,48 --- . ---
характерна для них в воде или в растворах сахарозы *. В меньшей степени это сказывается на белках, плавучая плотность которых в концентрированных растворах любой из солей близка к 1,3 г/см3,, зато плавучая плотность нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов увеличивается весьма существенно (табл. 4) [Birnie, 1978].
1 Существует точка зрения, согласно которой увеличение плавучей плотности биологических макромолекул связано еще и с проникновением ионов соли внутрь сольватных оболочек этих молекул.
р,г/см
US
1Л
XjMM
Рис. 64. Сопоставление картин распределения разных классов нуклеиновых кислот при одинаковых режимах центрифугирования в равновесных градиентах плотности растворов различных солей [Birnie, 1978]
/ — нативная ДНК; 2 — денатурированная ДНК; 3 -гибрид ДНК-РНК; 4 — РНК; a — Cs2S04 (po-l.Sl г/см3); б — CsCI (pool,75 г/см3); в-Nal (Ро“1,55 г/см8)
Хгмл
Из сопоставления данных таблицы с плотностями насыщенных солевых растворов ясно, что осуществить равновесное центрифугирование РНК в градиенте плотности CsCI невозможно, а в градиенте KI — весьма затруднительно.